Kỹ thuật nhuộm và quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi
1. Mục đích
1.1 Tìm hiểu các kỹ thuật cơ bản về phết và nhuộm vi khuẩn.
1.2 Nắm vững phương pháp nhuộm vi khuẩn đơn giản.
1.3 Hiểu sơ bộ về đặc điểm hình thái của vi khuẩn, củng cố kiến thức về cách sử dụng thấu kính dầu và kỹ thuật thao tác vô trùng.
2 nguyên tắc
Làm mờ và nhuộm vi khuẩn là một kỹ thuật cơ bản trong các thí nghiệm vi sinh. Tế bào vi khuẩn nhỏ và trong suốt nên khó xác định chúng dưới kính hiển vi ánh sáng thông thường; chúng phải được nhuộm màu. Một loại thuốc nhuộm duy nhất được sử dụng để nhuộm vi khuẩn, để vi khuẩn nhuộm màu tạo thành sự khác biệt màu sắc rõ ràng so với nền, để có thể quan sát hình thái và cấu trúc của chúng rõ ràng hơn. Phương pháp này dễ vận hành và thích hợp để quan sát hình dạng chung của tế bào vi khuẩn và sự sắp xếp của vi khuẩn. Thuốc nhuộm cơ bản thường được sử dụng để nhuộm đơn giản. Điều này là do trong các dung dịch trung tính, kiềm hoặc axit yếu, tế bào vi khuẩn thường tích điện âm và khi thuốc nhuộm cơ bản bị ion hóa, phần nhuộm của phân tử chúng tích điện dương nên chúng có tính kiềm. Phần nhuộm của thuốc nhuộm dễ dàng kết hợp với vi khuẩn để tạo màu cho chúng. Các tế bào vi khuẩn được nhuộm màu tương phản rõ rệt với nền, khiến chúng dễ dàng được xác định dưới kính hiển vi. Thuốc nhuộm thường được sử dụng để nhuộm đơn giản bao gồm xanh methylen, tím pha lê, fuchsin bazơ, v.v. Khi vi khuẩn phân hủy đường và tạo ra axit làm cho độ pH của môi trường nuôi cấy giảm xuống, điện tích dương trên vi khuẩn tăng lên. Lúc này, có thể sử dụng thuốc nhuộm có tính axit như eosin, axit fuchsin hoặc đỏ Congo để nhuộm màu. Vi khuẩn phải được cố định trước khi nhuộm. Nó có hai mục đích: một là tiêu diệt vi khuẩn và làm cho chúng bám vào phiến kính; cách khác là tăng ái lực của chúng với thuốc nhuộm. Hai phương pháp thường được sử dụng là gia nhiệt và cố định hóa học. Khi sửa chữa, cố gắng duy trì hình dạng ban đầu của các ô.
3 vật liệu
3.1 Vi khuẩn: Nuôi cấy thạch nghiêng Bacillus subtilis 12-18h, nuôi cấy nghiêng thạch dinh dưỡng Staphylococcus vàng 24h, nuôi cấy thạch nghiêng thạch dinh dưỡng Escherichia coli 24 giờ, nuôi cấy thạch nghiêng thạch nấm men của thợ làm bánh.
3.2 Chất nhuộm: Thuốc nhuộm xanh methylene kiềm của Lu (hoặc thuốc nhuộm tím tinh thể amoni oxalate), thuốc nhuộm fuchsin axit carbolic.
3.3 Dụng cụ hoặc các dụng cụ khác: kính hiển vi, đèn cồn, lam kính, vòng cấy, giá lam kính, chai hai lớp (chứa dầu tuyết tùng và xylene), khăn giấy lau kính, nước muối sinh lý hoặc nước cất, v.v.
4. Quy trình: bôi → sấy → cố định → nhuộm → rửa → sấy khô → kiểm tra bằng kính hiển vi.
5 bước
5.1 Phết phết: Lấy hai phiến kính sạch và không chứa dầu. Trong điều kiện vô trùng, nhỏ một giọt nước muối sinh lý thông thường (hoặc nước cất) vào mỗi tâm của phiến kính. Sử dụng vòng cấy để khử trùng vi khuẩn Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus và Escherichia coli, chọn một ít cỏ vi khuẩn trong giọt nước trên mặt nghiêng, trộn đều và bôi thành màng mỏng. Nếu bạn sử dụng phết huyền phù vi khuẩn (hoặc nuôi cấy lỏng), bạn có thể sử dụng vòng cấy để chọn 2 đến 3 vòng và bôi chúng trực tiếp lên lam kính. Chú ý không nhỏ quá nhiều nước muối sinh lý (nước cất) và loại bỏ vi khuẩn rồi thoa đều và không quá đặc.
5.2 Sấy Khô khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Bạn cũng có thể đun nóng nhẹ trên đèn cồn với mặt tráng hướng lên trên để làm khô. Nhưng hãy nhớ đừng đến quá gần ngọn lửa, vì nhiệt độ quá cao sẽ phá hủy hình thái của vi khuẩn.
5.3 Cố định Nếu sử dụng phương pháp sấy nóng, việc cố định và sấy khô được kết hợp thành một bước và phương pháp này cũng giống như sấy khô. Nhuộm, làm khô và cố định nhiệt.
5.4 Nhuộm: Đặt phiến kính nằm phẳng trên giá đỡ và thêm 1 đến 2 giọt dung dịch thuốc nhuộm lên vết phết (thích hợp là dung dịch thuốc nhuộm chỉ phủ lên màng phết). Nhuộm bằng xanh methylene cơ bản của Lu trong 1 đến 2 phút và nhuộm bằng axit carbolic fuchsin (hoặc tím tinh thể amoni oxalate) trong khoảng 1 phút.
5.5 Rửa bằng nước: Đổ hết dung dịch thuốc nhuộm và rửa nhẹ nhàng bằng nước máy từ một đầu của lam kính cho đến khi nước chảy xuống từ vết bẩn không màu. Khi rửa bằng nước, không rửa bề mặt tráng trực tiếp bằng nước. Lưu lượng nước không được quá nhanh hoặc quá lớn để tránh màng bôi bị bong ra.
5.6 Sấy khô: Lắc sạch những giọt nước trên lam kính và để khô tự nhiên, sấy khô bằng máy sấy tóc hoặc thấm bằng giấy thấm (cẩn thận không lau sạch vi khuẩn). 5.7 Kiểm tra bằng kính hiển vi Sau khi phết mẫu khô, tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi. Vết phết phải khô hoàn toàn trước khi quan sát bằng thấu kính dầu.
6 Kết quả Vẽ hình thái của E. coli và Micrococcus luteus quan sát được sau khi nhuộm một lần.
