Kỹ thuật nhuộm màu và quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi
Nhuộm vi khuẩn đơn giản
1 Mục tiêu
1.1 Tìm hiểu các kỹ thuật cơ bản về nhuộm và nhuộm vi sinh vật.
1.2 Nắm vững phương pháp nhuộm vi khuẩn đơn giản.
1.3 Tìm hiểu đặc điểm hình thái của vi khuẩn, củng cố việc học cách sử dụng gương dầu và kỹ thuật thao tác vô trùng.
2 Nguyên tắc Làm tiêu bản và nhuộm vi khuẩn là một kỹ thuật cơ bản trong thí nghiệm vi sinh. Tế bào của vi khuẩn nhỏ và trong suốt, dưới kính hiển vi ánh sáng thông thường không dễ nhận biết và phải nhuộm màu. Việc sử dụng một loại thuốc nhuộm duy nhất để nhuộm màu vi khuẩn, để sinh vật được nhuộm màu và nền tạo thành sự khác biệt về màu sắc rõ ràng, để có thể quan sát rõ hơn hình thái và cấu trúc của chúng. Phương pháp này dễ thực hiện và phù hợp cho việc quan sát hình dạng chung của sinh vật và sự sắp xếp của vi khuẩn. Thuốc nhuộm kiềm thường được sử dụng để nhuộm đơn giản, vì trong dung dịch trung tính, kiềm hoặc axit yếu, tế bào vi khuẩn thường tích điện âm và khi thuốc nhuộm kiềm bị ion hóa, phần nhuộm của phân tử của chúng sẽ tích điện dương, do đó phần nhuộm của thuốc nhuộm kiềm có thể dễ dàng liên kết với vi khuẩn để làm cho vi khuẩn có màu. Các tế bào vi khuẩn được nhuộm màu tương phản rõ rệt với nền và dễ nhận biết hơn dưới kính hiển vi. Thuốc nhuộm thường được sử dụng để nhuộm đơn giản bao gồm xanh merocyanine, tím pha lê và đỏ hợp chất cơ bản. Khi vi khuẩn phân hủy đường để tạo ra axit, độ pH của môi trường giảm, điện tích dương của vi khuẩn tăng lên, sau đó có thể được sử dụng để nhuộm màu đỏ, đỏ axit hoặc đỏ Congo và các thuốc nhuộm có tính axit khác. Vi khuẩn phải được cố định trước khi nhuộm. Mục đích của nó gồm hai phần: một là tiêu diệt vi khuẩn và làm cho vi khuẩn bám vào slide; thứ hai là tăng ái lực của nó với thuốc nhuộm. Hai phương pháp thường được sử dụng: gia nhiệt và cố định hóa học. Cố gắng duy trì hình thái ban đầu của tế bào khi cố định.
3 Vật liệu
3.1 Chủng Bacillus subtilis 12-18h nuôi cấy trên thạch nghiêng dinh dưỡng, Staphylococcus Aureus nuôi cấy trên thạch nghiêng khoảng 24 giờ, nuôi cấy trên thạch nghiêng thạch dinh dưỡng Escherichia coli 24 giờ, nuôi cấy trên thạch nghiêng thạch nấm men của thợ làm bánh.
3.2. Thuốc nhuộm Thuốc nhuộm xanh methylene kiềm của Lue (hoặc thuốc nhuộm tím tinh thể amoni oxalate), thuốc nhuộm màu đỏ hợp chất axit carbolic.
3.3 Dụng cụ hoặc các vật dụng khác Kính hiển vi, đèn cồn, lam kính, vòng cấy, giá giữ lam kính, chai hai lớp (chứa đầy dầu tuyết tùng và xylen), giấy hiển vi, nước muối sinh lý hoặc nước cất, v.v.
4 Quy trình Làm mẫu → làm khô → cố định → nhuộm → rửa → làm khô → kiểm tra bằng kính hiển vi.
5 bước
5.1 phết tế bào Lấy hai lam kính sạch và không có dầu, mỗi lam kính có một giọt nhỏ nước muối (hoặc nước cất) vào giữa lam kính trong điều kiện vô trùng, có vòng cấy để thao tác vô trùng, tương ứng, từ Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus và Escherichia coli nghiêng nhặt một ít rêu vào giọt nước, trộn đều và phủ một lớp màng. Nếu huyền phù vi khuẩn (hoặc nuôi cấy lỏng) bị nhòe, có thể dùng vòng cấy chọn 2 đến 3 vòng trực tiếp trên lam kính. Lưu ý nước muối (nước cất) và lấy vi khuẩn không nên quá nhiều và dàn đều, không quá đặc.
5.2 Sấy Khô khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Nó cũng có thể được làm khô bằng cách đun nóng nhẹ phía trên đèn cồn với mặt được phủ hướng lên trên. Tuy nhiên, không nên để quá gần ngọn lửa, vì nhiệt độ quá cao sẽ phá hủy hình thái của vi khuẩn.
5.3 Cố định Nếu sử dụng phương pháp sấy nhiệt, việc cố định và sấy khô được kết hợp thành một bước giống như cách làm khô. Nhuộm, làm khô và cố định nhiệt.
5.4 Thuốc nhuộm Đặt phiến kính nằm phẳng trên giá trượt, thêm 1 đến 2 giọt dung dịch nhuộm màu lên vết phết (dung dịch nhuộm chỉ phủ lên màng phết là phù hợp). Nhuộm vết bẩn bằng Xanh Mellanox cơ bản của Lü trong 1 ~ 2 phút và với Màu đỏ cacbonat (hoặc Tím tinh thể Ammonium Oxalate) trong khoảng 1 phút.
5.5 Rửa sạch Đổ hết dung dịch nhuộm màu và rửa nhẹ nhàng bằng nước máy từ một đầu của lam kính cho đến khi nước chảy xuống từ vết bẩn không màu. Khi tráng không được để nước chảy trực tiếp vào bề mặt sơn. Dòng nước không được quá nhanh hoặc quá lớn để tránh làm bong tróc màng bôi.
5.6 Sấy khô Lắc sạch các giọt nước trên lam kính cho khô tự nhiên, có thể dùng máy thổi khô hoặc giấy thấm để thấm khô (lưu ý không lau sạch xác vi khuẩn). 5.7 Kiểm tra bằng kính hiển vi Mẫu phết được làm khô và kiểm tra bằng kính hiển vi. Vết phết phải khô hoàn toàn trước khi có thể quan sát bằng kính hiển vi dầu.
6 Kết quả Vẽ hình thái của E. coli và Micrococcus garciniae sau khi nhuộm một lần.
Vết Gram
1 Mục đích
1.1 Hiểu được nguyên lý nhuộm Gram và tầm quan trọng của nó trong việc phân loại và định danh vi khuẩn.
1.2 Tìm hiểu và nắm vững kỹ thuật nhuộm Gram và củng cố việc học cách sử dụng thấu kính dầu của kính hiển vi ánh sáng.
