Phân loại và hoạt động của kính hiển vi nghiên cứu tế bào
Kính hiển vi là công cụ chính để quan sát tế bào. Theo các nguồn ánh sáng khác nhau, nó có thể được chia thành hai loại: kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử. Cái trước sử dụng ánh sáng khả kiến (kính hiển vi UV sử dụng tia cực tím) làm nguồn sáng, trong khi cái sau sử dụng chùm tia điện tử làm nguồn sáng.
-,Kính hiển vi quang học
(1) Kính hiển vi quang học thông thường
Kính hiển vi sinh học thông thường bao gồm ba phần, cụ thể là: ① hệ thống chiếu sáng, bao gồm nguồn sáng và thiết bị ngưng tụ; ② hệ thống phóng đại quang học, bao gồm vật kính và thị kính, là phần thân chính của kính hiển vi. Để loại bỏ quang sai hình cầu và quang sai màu, cả thị kính và vật kính ③Thiết bị cơ học, được sử dụng để cố định vật liệu và hỗ trợ quan sát (Hình 2-1).
Hình ảnh của kính hiển vi có rõ ràng hay không không chỉ được xác định bởi độ phóng đại mà còn liên quan đến độ phân giải của kính hiển vi. Độ phân giải đề cập đến khả năng của kính hiển vi (hoặc mắt người cách mục tiêu 25cm) để phân biệt khoảng cách nhỏ nhất giữa các vật thể. Kích thước của độ phân giải được xác định bởi Tỷ lệ bước sóng và độ mở của ánh sáng và chiết suất của môi trường được biểu thị bằng công thức:
Trong công thức: n{0}} chiết suất của môi trường; Góc khẩu độ=(góc mở của mẫu vật so với khẩu độ ống kính vật kính), khẩu độ ống kính=NA (khẩu độ số). Góc thấu kính luôn nhỏ hơn 180 độ, vì vậy giá trị tối đa của sina/2 phải nhỏ hơn 1.
Chiết suất của thủy tinh được sử dụng để làm thấu kính quang học là 1,65 đến 1,78 và chiết suất của môi trường được sử dụng càng gần thủy tinh thì càng tốt. Đối với vật kính khô, môi trường là không khí và tỷ lệ độ mở ống kính thường là 0.05 đến 0,95; đối với ống kính dầu, dầu tuyết tùng được sử dụng làm phương tiện và tỷ lệ khẩu độ của ống kính có thể gần bằng 1,5.
Bước sóng của ánh sáng thông thường là {{0}}nm, vì vậy giá trị độ phân giải của kính hiển vi sẽ không nhỏ hơn 0.2μm và độ phân giải của mắt người là 0,2mm, do đó độ phóng đại tối đa của thiết kế kính hiển vi nói chung thường là 1000X.
(2) Kính hiển vi huỳnh quang
Một số chất trong tế bào, chẳng hạn như chất diệp lục, có thể phát huỳnh quang sau khi được chiếu bởi tia cực tím; bản thân một số chất không thể phát huỳnh quang, nhưng nếu chúng được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc kháng thể huỳnh quang, chúng cũng có thể phát huỳnh quang khi được chiếu tia cực tím và kính hiển vi huỳnh quang (Hình 2-2, 3, 4) là một trong những công cụ cho nghiên cứu định tính và định lượng về các chất đó.
Kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi thông thường có những điểm khác biệt sau:
1. Phương pháp chiếu sáng thường là chiếu sáng epi, tức là chiếu nguồn sáng lên mẫu qua vật kính (Hình 2-3);
2. Nguồn sáng là tia cực tím, bước sóng ngắn hơn và độ phân giải cao hơn so với kính hiển vi thông thường;
3. Có hai bộ lọc đặc biệt, bộ lọc phía trước nguồn sáng được sử dụng để lọc ánh sáng khả kiến và bộ lọc nằm giữa thị kính và vật kính được sử dụng để lọc tia cực tím để bảo vệ mắt.
(3) Kính hiển vi đồng tiêu quét laser
Kính hiển vi quét đồng tiêu laze (laser kính hiển vi quét đồng tiêu, Hình 2-5, 6) sử dụng laze làm nguồn sáng quét và quét hình ảnh từng điểm, từng đường, từng bề mặt và bộ sưu tập tia laze quét và huỳnh quang chia sẻ một vật kính, và tiêu điểm của vật kính là Tiêu điểm của tia laser quét cũng là điểm đối tượng của hình ảnh tức thời. Do bước sóng của chùm tia laze ngắn và chùm tia rất mỏng nên kính hiển vi quét laze đồng tiêu có độ phân giải cao hơn, gấp khoảng 3 lần so với kính hiển vi quang học thông thường. Hệ thống được lấy nét một lần và quá trình quét được giới hạn trong một mặt phẳng của mẫu. Khi độ sâu lấy nét khác nhau, có thể thu được hình ảnh ở các mức độ sâu khác nhau của mẫu. Những thông tin hình ảnh này được lưu trữ trong máy tính. Thông qua phân tích và mô phỏng trên máy tính, cấu trúc ba chiều của mẫu tế bào có thể được hiển thị.
Kính hiển vi quét laser đồng tiêu không chỉ được sử dụng để quan sát hình thái tế bào mà còn để phân tích định lượng các thành phần sinh hóa nội bào, thống kê mật độ quang và đo lường hình thái tế bào.
(4) Kính hiển vi trường tối
Kính hiển vi trường tối (kính hiển vi trường tối, Hình 2-7) có một tấm sáng ở trung tâm của tụ quang, để ánh sáng chiếu sáng không trực tiếp đi vào thấu kính của con người mà chỉ có ánh sáng phản xạ và nhiễu xạ bởi mẫu vật được phép đi vào vật kính, do đó nền của trường nhìn có màu đen, Các cạnh của vật thể sáng. Khi sử dụng kính hiển vi này, có thể nhìn thấy các hạt nhỏ cỡ 4-200nm và độ phân giải có thể cao hơn 50 lần so với độ phân giải của kính hiển vi thông thường.
(5) Kính hiển vi tương phản pha
Kính hiển vi tương phản pha (phasecontrast microscope, Hình 2-8, 9) của P. Zernike được phát minh vào năm 1932 và đoạt giải Nobel Vật lý năm 1953 cho nó. Tính năng lớn nhất của kính hiển vi này là nó có thể quan sát các mẫu vật và tế bào sống không nhuộm màu.
Nguyên tắc cơ bản của kính hiển vi tương phản pha là thay đổi chênh lệch đường quang của ánh sáng khả kiến đi qua mẫu vật thành chênh lệch biên độ, do đó cải thiện độ tương phản giữa các cấu trúc khác nhau và làm cho các cấu trúc khác nhau có thể nhìn thấy rõ ràng. Sau khi đi qua mẫu vật, ánh sáng bị khúc xạ, lệch khỏi quang lộ ban đầu và bị trễ 1/4λ (bước sóng). Tăng cường, tăng giảm biên độ, tăng độ tương phản. Về cấu tạo, kính hiển vi tương phản pha có 2 điểm đặc biệt khác với kính hiển vi quang học thông thường:
1. Màng chắn hình khuyên nằm giữa nguồn sáng và tụ quang, chức năng của nó là làm cho ánh sáng đi qua tụ quang tạo thành hình nón ánh sáng rỗng và tập trung vào mẫu vật.
2. Tấm pha (tấm pha hình khuyên) thêm một tấm pha được phủ magie florua trong vật kính, có thể làm trễ pha của ánh sáng trực tiếp hoặc ánh sáng nhiễu xạ 1/4λ. Có hai loại:
①Một tấm pha cộng: Ánh sáng trực tiếp bị trễ 1/4λ. Sau khi hai nhóm sóng ánh sáng được kết hợp, các sóng ánh sáng được thêm vào với nhau và biên độ được tăng lên. Cấu trúc của mẫu vật sáng hơn môi trường xung quanh, tạo thành độ tương phản sáng (hoặc độ tương phản âm).
② Tấm pha B cộng: Ánh sáng nhiễu xạ bị trễ 1/4λ. Sau khi hai bộ tia được kết hợp, các sóng ánh sáng bị trừ đi và biên độ trở nên nhỏ hơn, tạo thành độ tương phản tối (hoặc độ tương phản dương) và cấu trúc tối hơn môi trường xung quanh.
