Có hai loại kính hiển vi huỳnh quang xét về đường quang học của chúng
1. Kính hiển vi huỳnh quang truyền qua: Nguồn sáng kích thích được truyền qua vật liệu tiêu bản thông qua thấu kính hội tụ để kích thích huỳnh quang. Bộ thu trường tối thường được sử dụng và bộ thu thông thường cũng có thể được sử dụng để điều chỉnh gương sao cho ánh sáng kích thích được chuyển hướng và đi vòng qua mẫu vật. Đây là một kính hiển vi huỳnh quang cũ hơn. Ưu điểm là huỳnh quang mạnh ở độ phóng đại thấp, nhưng nhược điểm là huỳnh quang giảm khi độ phóng đại tăng. Do đó, tốt hơn là quan sát các vật liệu mẫu vật lớn hơn.
2. Kính hiển vi huỳnh quang Epi là một loại kính hiển vi huỳnh quang mới được phát triển trong thời hiện đại. Sự khác biệt là ánh sáng kích thích rơi từ vật kính xuống bề mặt của mẫu vật, nghĩa là, cùng một vật kính được sử dụng làm tụ quang và vật kính để thu huỳnh quang. Một bộ tách chùm lưỡng sắc cần được thêm vào đường đi của ánh sáng, cách urani nhẹ 45 độ. Ánh sáng kích thích được phản xạ vào vật kính và được thu thập trên mẫu. Huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu và ánh sáng kích thích được phản xạ bởi bề mặt thấu kính của vật kính và bề mặt kính che đi vào thấu kính vật kính cùng một lúc và quay trở lại bộ tách chùm hai màu để làm cho ánh sáng kích thích được tách ra khỏi huỳnh quang , ánh sáng kích thích còn lại được hấp thụ bởi các bộ lọc chặn. Chẳng hạn như thay đổi thành sự kết hợp của bộ lọc kích thích/bộ tách chùm tia hai màu/bộ lọc chặn khác nhau, nó có thể đáp ứng nhu cầu của các sản phẩm phản ứng huỳnh quang khác nhau. Ưu điểm của loại kính hiển vi huỳnh quang này là sự chiếu sáng của trường nhìn đồng đều, hình ảnh rõ nét và độ phóng đại càng lớn thì huỳnh quang càng mạnh.
