Phương pháp quan sát chính của kính hiển vi quang học là quan sát huỳnh quang
Huỳnh quang đề cập đến quá trình trong đó một chất huỳnh quang phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn gần như đồng thời khi nó được chiếu xạ bằng ánh sáng có bước sóng cụ thể (Hình 1). Khi ánh sáng có bước sóng cụ thể (bước sóng kích thích) chiếu vào một phân tử, chẳng hạn như ánh sáng trong chất huỳnh quang, năng lượng photon được hấp thụ bởi các electron của phân tử. Tiếp theo, các electron chuyển từ trạng thái cơ bản (S0) lên mức năng lượng cao hơn, trạng thái kích thích (S1'). Quá trình này được gọi là kích thích①. Electron ở trạng thái kích thích trong 10-9–10-8 giây, trong thời gian đó, electron mất một phần năng lượng②. Trong quá trình các electron rời khỏi trạng thái kích thích (S1) và trở về trạng thái cơ bản③, năng lượng còn lại được hấp thụ trong quá trình kích thích được giải phóng.
Thời gian lưu trú của phân tử huỳnh quang ở trạng thái kích thích là thời gian tồn tại huỳnh quang, thường ở cấp độ nano giây và là một đặc tính vốn có của chính phân tử huỳnh quang. Tạo ảnh suốt đời huỳnh quang (FLIM), sử dụng công nghệ tạo ảnh trọn đời huỳnh quang, được gọi là tạo ảnh trọn đời huỳnh quang (FLIM). Ngoài hình ảnh cường độ huỳnh quang, có thể thu được các phép đo chính xác và chức năng chuyên sâu hơn để thu được cấu trúc phân tử, tương tác giữa các phân tử và môi trường vi mô của các phân tử. Thông tin khó có được với hình ảnh quang học thông thường.
Một tính chất quan trọng khác của huỳnh quang là dịch chuyển Stokes, sự khác biệt về bước sóng giữa cực đại kích thích và cực đại phát xạ (Hình 2). Thông thường, bước sóng phát xạ dài hơn bước sóng kích thích. Điều này là do các electron sẽ mất một phần năng lượng của chúng thông qua quá trình hồi phục sau khi chất huỳnh quang bị kích thích và trước khi giải phóng các photon. Các chất huỳnh quang có độ dịch chuyển Stokes càng lớn thì càng dễ quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Kính hiển vi huỳnh quang và khối lọc huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang là kính hiển vi quang học sử dụng các đặc tính huỳnh quang để quan sát và chụp ảnh, được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như sinh học tế bào, sinh học thần kinh, thực vật học, vi sinh, bệnh lý và di truyền học. Hình ảnh huỳnh quang có ưu điểm là độ nhạy cao và độ đặc hiệu cao, rất phù hợp để quan sát sự phân bố của các protein và bào quan cụ thể trong mô và tế bào, nghiên cứu về sự tập trung và tương tác, theo dõi các quá trình năng động của sự sống như thay đổi nồng độ ion , vân vân.
Hầu hết các phân tử trong tế bào không phát huỳnh quang và để nhìn thấy chúng, chúng phải được dán nhãn huỳnh quang. Có nhiều phương pháp đánh dấu huỳnh quang, chẳng hạn như đánh dấu trực tiếp (chẳng hạn như sử dụng DAPI để đánh dấu DNA), hoặc tạo miễn dịch bằng cách sử dụng các đặc tính liên kết kháng nguyên của kháng thể hoặc sử dụng các protein huỳnh quang (như GFP, protein huỳnh quang xanh lục) để đánh dấu các protein mục tiêu. , và ràng buộc đảo ngược. Thuốc nhuộm tổng hợp (chẳng hạn như Fura-2), v.v.
Hiện tại, kính hiển vi huỳnh quang đã trở thành thiết bị chụp ảnh tiêu chuẩn của nhiều phòng thí nghiệm và nền tảng chụp ảnh khác nhau, đồng thời là một trợ thủ đắc lực cho các thí nghiệm hàng ngày của chúng ta. Kính hiển vi huỳnh quang chủ yếu được chia thành ba loại: kính hiển vi huỳnh quang thẳng đứng (thích hợp để cắt lát), kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược (thích hợp cho tế bào sống, có tính đến việc cắt lát), kính soi nổi huỳnh quang (thích hợp cho các mẫu vật lớn hơn, chẳng hạn như thực vật, cá ngựa vằn (trưởng thành/phôi) ) , medaka, nội tạng chuột/chuột, v.v.).
Khối lọc huỳnh quang là thành phần cốt lõi của hình ảnh huỳnh quang kính hiển vi. Nó bao gồm ba phần: bộ lọc kích thích, bộ lọc phát xạ và bộ tách chùm lưỡng sắc. Nó được cài đặt trong bánh xe lọc. Ví dụ: Leica DMi8 được trang bị 6-bánh xe bộ lọc định vị (Hình 3 ). Số lượng vị trí của các bánh xe kính hiển vi khác nhau sẽ khác nhau và một số kính hiển vi sử dụng các phiến khối bộ lọc.
Khối bộ lọc đóng một vai trò quan trọng trong hình ảnh huỳnh quang: bộ lọc kích thích chọn ánh sáng kích thích để kích thích mẫu và chặn ánh sáng có bước sóng khác; ánh sáng đi qua bộ lọc kích thích đi qua gương lưỡng sắc (chức năng của nó là phản xạ ánh sáng kích thích và truyền huỳnh quang), Sau khi phản xạ, nó được hội tụ bởi vật kính, chiếu xạ mẫu và kích thích huỳnh quang tương ứng, đó là , ánh sáng phát ra. Ánh sáng phát ra được thu thập bởi vật kính, đi qua bộ tách chùm lưỡng sắc và đến bộ lọc phát xạ. Như được hiển thị trong Hình 4: bước sóng kích thích là 450-490nm, gương lưỡng sắc phản xạ ánh sáng ngắn hơn 510nm, truyền ánh sáng dài hơn 510nm và phạm vi tiếp nhận của ánh sáng phát ra là 520-560nm.
