Phương pháp quan sát chính của kính hiển vi quang học là quan sát huỳnh quang
hiện tượng huỳnh quang
Huỳnh quang đề cập đến quá trình trong đó một chất huỳnh quang phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn gần như đồng thời khi được chiếu xạ bằng ánh sáng có bước sóng cụ thể (Hình 1). Khi ánh sáng có bước sóng cụ thể (bước sóng kích thích) chiếu vào một phân tử (chẳng hạn như một phân tử trong chất huỳnh quang), năng lượng photon được hấp thụ bởi các electron của phân tử. Tiếp theo, các electron chuyển từ trạng thái cơ bản (S0) lên mức năng lượng cao hơn, trạng thái kích thích (S1'). Quá trình này được gọi là kích thích①. Electron ở trạng thái kích thích trong 10-9–10-8 giây, trong thời gian đó electron mất đi một phần năng lượng ②. Trong quá trình rời khỏi trạng thái kích thích (S1) và trở về trạng thái cơ bản ③, năng lượng còn lại được hấp thụ trong quá trình kích thích sẽ được giải phóng.
Thời gian lưu trú của phân tử huỳnh quang ở trạng thái kích thích là thời gian tồn tại của huỳnh quang, thường tính bằng nano giây, đây là đặc tính cố hữu của chính phân tử huỳnh quang. Công nghệ chụp ảnh sử dụng tuổi thọ huỳnh quang được gọi là Chụp ảnh trọn đời huỳnh quang (FLIM), có thể thực hiện các phép đo chính xác và chức năng chuyên sâu hơn ngoài chụp ảnh cường độ huỳnh quang để thu được cấu trúc phân tử, tương tác giữa các phân tử và môi trường vi mô phân tử. thông tin khó có được với hình ảnh quang học thông thường.
Một tính chất quan trọng khác của huỳnh quang là dịch chuyển Stokes, sự khác biệt về bước sóng giữa cực đại kích thích và cực đại phát xạ (Hình 2). Thông thường bước sóng ánh sáng phát xạ dài hơn bước sóng ánh sáng kích thích. Điều này là do sau khi chất huỳnh quang được kích thích và trước khi photon được giải phóng, các electron sẽ mất một phần năng lượng thông qua quá trình thư giãn. Các chất huỳnh quang có độ dịch chuyển Stokes càng lớn thì càng dễ quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Kính hiển vi huỳnh quang và Khối lọc huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang là kính hiển vi quang học sử dụng các đặc tính huỳnh quang để quan sát và hình ảnh, được sử dụng rộng rãi trong sinh học tế bào, sinh học thần kinh, thực vật học, vi sinh, bệnh lý, di truyền học và các lĩnh vực khác. Hình ảnh huỳnh quang có ưu điểm là độ nhạy cao và độ đặc hiệu cao, rất phù hợp để quan sát sự phân bố của các protein, bào quan cụ thể, v.v. trong các mô và tế bào, nghiên cứu về đồng địa hóa và tương tác, cũng như theo dõi động lực của sự sống. các quá trình như thay đổi nồng độ ion.
Hầu hết các phân tử trong tế bào không phát huỳnh quang và để nhìn thấy chúng, chúng phải được dán nhãn huỳnh quang. Có nhiều phương pháp đánh dấu huỳnh quang, có thể đánh dấu trực tiếp (chẳng hạn như sử dụng DAPI để đánh dấu DNA), hoặc tạo miễn dịch bằng cách sử dụng đặc tính liên kết kháng nguyên của kháng thể hoặc protein mục tiêu có thể được đánh dấu bằng protein huỳnh quang (chẳng hạn như GFP, màu xanh lá cây). protein huỳnh quang), hoặc liên kết thuận nghịch. thuốc nhuộm tổng hợp (chẳng hạn như Fura-2), v.v.
Hiện tại, kính hiển vi huỳnh quang đã trở thành thiết bị hình ảnh tiêu chuẩn của nhiều phòng thí nghiệm và nền tảng hình ảnh khác nhau, và nó là một trợ thủ đắc lực cho các thí nghiệm hàng ngày của chúng ta. Kính hiển vi huỳnh quang chủ yếu được chia thành ba loại: kính hiển vi huỳnh quang thẳng đứng (thích hợp để cắt), kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược (thích hợp cho các tế bào sống, có tính đến các phần), kính hiển vi soi nổi huỳnh quang (thích hợp cho các mẫu vật lớn hơn, chẳng hạn như thực vật, cá ngựa vằn (người lớn/ phôi) , medaka, cơ quan chuột/chuột, v.v.).
Khối lọc huỳnh quang là thành phần cốt lõi của hình ảnh huỳnh quang trong kính hiển vi. Nó bao gồm một bộ lọc kích thích, một bộ lọc phát xạ và một bộ tách chùm lưỡng sắc. Nó được lắp vào bánh xe lọc, chẳng hạn như Leica DMi8 được trang bị 6-bánh xe lọc vị trí (Hình 3). ). Các kính hiển vi khác nhau có các vị trí bánh xe khác nhau và một số kính hiển vi sử dụng các phiến kính lọc.
Khối bộ lọc đóng một vai trò quan trọng trong hình ảnh huỳnh quang: bộ lọc kích thích chọn ánh sáng kích thích để kích thích mẫu và chặn các bước sóng ánh sáng khác; ánh sáng đi qua bộ lọc kích thích đi qua bộ tách chùm lưỡng sắc (vai trò của nó là phản xạ ánh sáng kích thích và truyền huỳnh quang), Sau khi phản xạ, nó được hội tụ bởi vật kính, chiếu xạ vào mẫu và huỳnh quang tương ứng được kích thích để Phát ra ánh sáng. Ánh sáng phát ra được thu thập bởi vật kính, đi qua bộ tách chùm lưỡng sắc và đến bộ lọc phát xạ. Như được hiển thị trong Hình 4: bước sóng kích thích là 450-490nm, bộ tách chùm lưỡng sắc phản xạ ánh sáng ngắn hơn 510nm, truyền ánh sáng dài hơn 510nm và phạm vi nhận ánh sáng phát xạ là 520-560nm.
Bộ lọc huỳnh quang thường được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang có thể được chia thành hai loại: long pass (viết tắt là LP) và band pass (viết tắt là BP). Dải thông thường được xác định bởi bước sóng trung tâm và độ rộng của khoảng, chẳng hạn như 480/40, có nghĩa là ánh sáng từ 460-500nm có thể đi qua. Longpass filter, chẳng hạn như 515 LP, cho ánh sáng có bước sóng dài hơn 515 nm đi qua (Hình 5).
Các chất huỳnh quang có đường cong kích thích (hấp thụ) và đường cong phát xạ đặc trưng, đỉnh kích thích là bước sóng kích thích lý tưởng (hiệu suất kích thích cao, có thể làm giảm năng lượng ánh sáng kích thích, bảo vệ tế bào và thuốc nhuộm), và đường cong phát xạ là bước sóng huỳnh quang phát xạ phạm vi. Do đó, trong thử nghiệm, chúng tôi sẽ chọn bước sóng càng gần với cực đại kích thích càng tốt để kích thích và phạm vi thu cần bao gồm cực đại phát xạ. Ví dụ: đỉnh kích thích của Alexa Fluor 488 là 500nm và bộ lọc kích thích 480/40 có thể được chọn trong kính hiển vi huỳnh quang.
Chi tiết về các khối lọc có thể được xem trong phần mềm hình ảnh kính hiển vi. Hiểu thuốc nhuộm và tìm bộ lọc phù hợp nhất với mẫu của bạn là rất quan trọng đối với hình ảnh huỳnh quang. Thông tin quang phổ của thuốc nhuộm huỳnh quang và protein huỳnh quang thường được nêu trong hướng dẫn và cũng có thể tìm thấy trực tuyến.
Ngoài các bước sóng kích thích và phát xạ của đầu dò huỳnh quang, việc lựa chọn các khối lọc cũng cần xem xét liệu có kích thích không đặc hiệu hay không và liệu có màu chéo đối với các mẫu được dán nhãn nhiều màu hay không. Ngoài ra, cần xem xét nguồn sáng huỳnh quang được sử dụng. Hiện nay, các nguồn sáng huỳnh quang thường được sử dụng bao gồm đèn thủy ngân, đèn halogen kim loại và nguồn sáng LED đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây. Quang phổ của nguồn sáng huỳnh quang là liên tục hoặc không liên tục và năng lượng sẽ khác nhau trong các dải bước sóng khác nhau. Nguồn sáng LED đang dần trở thành nguồn sáng chính của kính hiển vi huỳnh quang do dải phổ tương đối hẹp, năng lượng đầu ra ổn định hơn, tuổi thọ cao, an toàn hơn và bảo vệ môi trường cùng nhiều ưu điểm khác.
Ngoài khối lọc tích hợp của kính hiển vi, còn có một bánh xe nhanh bên ngoài (Hình 7). Tốc độ chuyển đổi của bộ lọc liền kề với bánh xe nhanh bên ngoài của Leica là 27ms, có thể thực hiện các thử nghiệm đa màu tốc độ cao, chẳng hạn như hình ảnh canxi tỷ lệ FRET và Fura2. (Hình 8) và cộng sự.
Một loạt các kỹ thuật hình ảnh kính hiển vi huỳnh quang
Để đáp ứng các nhu cầu chụp ảnh huỳnh quang khác nhau, ngoài kính hiển vi huỳnh quang, nhiều giải pháp chụp ảnh kính hiển vi huỳnh quang khác nhau đã được phát triển:
Các hệ thống hình ảnh độ phân giải cao trường rộng, chẳng hạn như Leica THUNDER Imager, sử dụng công nghệ Clearing cải tiến của Leica để loại bỏ hiệu quả các tín hiệu nhiễu của mặt phẳng không tiêu điểm trong quá trình chụp ảnh, thể hiện hình ảnh rõ nét và lợi thế của hình ảnh tốc độ cao;
Kính hiển vi quét laser đồng tiêu sử dụng các lỗ kim để loại bỏ nhiễu của mặt phẳng không tiêu cự, thực hiện phân vùng quang học và thu được hình ảnh độ nét cao và hình ảnh ba chiều;
Kính hiển vi độ phân giải cực cao và kính hiển vi nano vượt qua giới hạn nhiễu xạ có thể quan sát các cấu trúc mịn nhỏ hơn 200 nm;
Một hệ thống chụp ảnh đa điểm sử dụng nguyên lý kích thích đa điểm ảnh để chụp ảnh mô dày và sâu trong cơ thể sống;
Công nghệ tạo ảnh tấm sáng với độ phân giải không gian và thời gian cao, tốc độ tạo ảnh nhanh, độ phân giải cao, độc tính quang thấp, đặc biệt thích hợp cho nghiên cứu phát triển và quan sát động in vivo;
Hình ảnh tuổi thọ huỳnh quang (FLIM), không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ chất huỳnh quang, tẩy trắng quang, cường độ ánh sáng kích thích, v.v., có thể thực hiện các phép đo chức năng chuyên sâu và chính xác hơn;
Quang phổ tương quan huỳnh quang (FCS) và Quang phổ tương quan chéo huỳnh quang (FCCS), đo số lượng phân tử và hệ số khuếch tán của các phân tử huỳnh quang, từ đó phân tích nồng độ phân tử, kích thước phân tử, độ nhớt, chuyển động phân tử, liên kết/phân ly phân tử và tính chất quang học phân tử;
Kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (TIRF), với độ phân giải trục z cực cao, rất lý tưởng để nghiên cứu cấu trúc phân tử và động lực học của bề mặt màng tế bào.
