Sự khác biệt giữa kính hiển vi huỳnh quang (hai photon, đồng tiêu) và kính hiển vi thông thường
Nguyên tắc cơ bản của kích thích hai photon là ở mật độ photon cao, các phân tử huỳnh quang có thể hấp thụ đồng thời hai photon bước sóng dài và phát ra một photon bước sóng ngắn hơn sau một thời gian ngắn được gọi là tuổi thọ trạng thái kích thích; Hiệu ứng giống như sử dụng một photon với một nửa bước sóng của bước sóng dài để kích thích các phân tử huỳnh quang. Hai kích thích photon đòi hỏi mật độ photon cao và để tránh các tế bào gây hại, kính hiển vi hai photon sử dụng các laser xung bị khóa chế độ năng lượng cao. Laser phát ra từ laser này có năng lượng cực đại cao và năng lượng trung bình thấp, với chiều rộng xung chỉ 100 femtoseconds và tần số lên tới 80 đến 100 megahertz. Khi sử dụng ống kính mục tiêu khẩu độ số cao để tập trung các photon của laser xung, mật độ photon tại tiêu điểm của ống kính khách quan là kích thích cao nhất và hai photon chỉ xảy ra ở điểm tiêu cự của ống kính khách quan. Do đó, kính hiển vi hai photon không cần một lỗ kim tiêu điểm, giúp cải thiện hiệu quả phát hiện huỳnh quang.
Trong các hiện tượng huỳnh quang nói chung, do mật độ photon thấp của ánh sáng kích thích, một phân tử huỳnh quang chỉ có thể hấp thụ một photon tại một thời điểm và sau đó phát ra một photon huỳnh quang khác thông qua quá trình chuyển phát xạ, được gọi là huỳnh quang đơn. Đối với các quá trình kích thích huỳnh quang sử dụng tia laser làm nguồn sáng, hiện tượng huỳnh quang hai photon hoặc thậm chí có thể xảy ra. Trong trường hợp này, nguồn sáng kích thích được sử dụng có cường độ cao và mật độ photon đáp ứng yêu cầu đối với các phân tử huỳnh quang để hấp thụ hai photon đồng thời. Trong quá trình sử dụng laser chung làm nguồn sáng kích thích, mật độ photon vẫn không đủ để tạo ra hiện tượng hấp thụ hai photon. Thông thường, laser xung femtosecond được sử dụng, với sức mạnh tức thời đạt đến mức megawatt. Do đó, bước sóng của huỳnh quang hai photon ngắn hơn so với ánh sáng kích thích, tương đương với hiệu ứng được tạo ra bởi một nửa kích thích bước sóng kích thích.
Kiến thức liên quan đến kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu
Nguyên tắc cơ bản của kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu là sử dụng nguồn sáng điểm để chiếu xạ mẫu vật, tạo thành một điểm ánh sáng nhỏ được xác định rõ trên mặt phẳng tiêu cự. Sự phát huỳnh quang phát ra từ vị trí này sau khi chiếu xạ được thu thập bởi ống kính khách quan và được gửi trở lại dọc theo đường chiếu xạ ban đầu đến bộ chia chùm tia bao gồm một gương lưỡng sắc. Máy quang phổ gửi huỳnh quang trực tiếp đến máy dò. Có một lỗ kim ở phía trước của cả nguồn sáng và máy dò, được gọi là lỗ kim chiếu sáng và lỗ kim phát hiện tương ứng. Kích thước hình học của cả hai là nhất quán, xấp xỉ 100-200 nm; So với điểm ánh sáng trên mặt phẳng tiêu cự, cả hai là liên hợp, có nghĩa là điểm ánh sáng đi qua một loạt các ống kính và cuối cùng có thể tập trung vào cả pinhole chiếu sáng và pinhole phát hiện đồng thời. Theo cách này, ánh sáng từ mặt phẳng tiêu cự có thể hội tụ trong phạm vi của lỗ phát hiện, trong khi ánh sáng rải rác từ trên hoặc dưới mặt phẳng tiêu cự bị chặn bên ngoài lỗ phát hiện và không thể chụp được. Quét điểm mẫu từng điểm bằng tia laser, ống quang hóa sau khi phát hiện lỗ kim cũng thu được hình ảnh đồng tiêu tương ứng của điểm điểm sáng từng điểm, chuyển nó thành tín hiệu kỹ thuật số và truyền nó vào máy tính và cuối cùng kết hợp nó thành hình ảnh rõ ràng của toàn bộ mặt phẳng tiêu điểm trên màn hình.
