Nguyên lý của kính hiển vi đồng tiêu laser (LSCM)
Kính hiển vi đồng tiêu laser sử dụng lỗ kim chiếu sáng đặt phía sau nguồn sáng và lỗ kim phát hiện đặt trước máy dò để đạt được độ chiếu sáng điểm và phát hiện điểm. Ánh sáng từ nguồn sáng được tập trung vào một điểm trong mặt phẳng tiêu cự của mẫu bằng ánh sáng phát ra qua lỗ kim chiếu sáng và huỳnh quang phát ra từ điểm đó được ghi lại trong lỗ kim phát hiện và mọi ánh sáng phát ra bên ngoài điểm đó đều bị chặn bởi lỗ kim phát hiện. Lỗ kim chiếu sáng và lỗ kim phát hiện được liên hợp cho điểm được chiếu sáng hoặc điểm được phát hiện, do đó điểm được phát hiện là tiêu điểm và mặt phẳng nơi đặt điểm được phát hiện là mặt phẳng tiêu điểm. Máy tính hiển thị điểm được phát hiện trên màn hình máy tính dưới dạng điểm ảnh. Để tạo ra một hình ảnh hoàn chỉnh, một hệ thống quét trong đường quang sẽ quét qua mặt phẳng tiêu điểm của mẫu, từ đó tạo ra một hình ảnh tiêu điểm hoàn chỉnh. Miễn là tầng mang được di chuyển lên và xuống dọc theo trục Z, một mức mới của mẫu sẽ được di chuyển đến mặt phẳng tiêu điểm và mức mới của mẫu sẽ được ghi ảnh trên màn hình, khi trục Z tiếp tục di chuyển. di chuyển, thu được các hình ảnh cắt ánh sáng liên tiếp ở các cấp độ khác nhau của mẫu.
Kính hiển vi quang học truyền thống sử dụng nguồn sáng trường, hình ảnh của từng điểm trên mẫu vật sẽ bị nhiễu xạ hoặc tán xạ ánh sáng từ các điểm lân cận; kính hiển vi đồng tiêu quét laser sử dụng chùm tia laser xuyên qua lỗ kim được chiếu sáng để tạo thành nguồn sáng điểm trên mẫu vật được quét tại mỗi điểm của mặt phẳng tiêu cự bên trong, mẫu vật trên điểm được chiếu xạ, hình ảnh của lỗ kim phát hiện, bằng cách phát hiện lỗ kim sau điểm của ống nhân ánh sáng (PMT) hoặc thiết bị ghép điện lạnh (cCCD) Nhận được từng điểm hoặc từng dòng, hình ảnh huỳnh quang nhanh chóng được hình thành trên màn hình điều khiển máy tính. Lỗ kim chiếu sáng và lỗ kim phát hiện so với mặt phẳng tiêu của thấu kính vật kính là liên hợp, điểm trên mặt phẳng tiêu điểm đồng thời tập trung vào lỗ kim chiếu sáng và lỗ kim phát xạ, điểm bên ngoài mặt phẳng tiêu điểm sẽ không nằm trong phạm vi phát hiện của lỗ kim ở hình ảnh, sao cho hình ảnh đồng tiêu thu được là mặt cắt quang học của mẫu vật, khắc phục những thiếu sót của hình ảnh mờ của kính hiển vi thông thường.
Từ nguyên lý cơ bản, kính hiển vi đồng tiêu laser là một kính hiển vi quang học hiện đại, nó là kính hiển vi ánh sáng thông thường từ công nghệ để thực hiện những cải tiến sau.
1. Sử dụng tia laser làm nguồn sáng vì tính đơn sắc của tia laser rất tốt, bước sóng của chùm nguồn sáng giống nhau, về cơ bản loại bỏ hiện tượng quang sai màu.
2. Việc sử dụng công nghệ tiêu điểm trong mặt phẳng tiêu cự của thấu kính vật kính đặt ở giữa có một lỗ nhỏ trên vách ngăn, mặt phẳng tiêu cự bên ngoài chặn ánh sáng lạc, loại bỏ quang sai hình cầu; và tiếp tục loại bỏ quang sai màu.
3. Kính hiển vi đồng tiêu laser sử dụng công nghệ quét điểm để phân tách mẫu thành không gian hai chiều hoặc ba chiều thành vô số điểm, bằng chùm tia laser rất nhỏ (nguồn sáng điểm) từng điểm, chụp ảnh quét từng đường, rồi xuyên qua sự kết hợp máy vi tính của toàn bộ mặt phẳng hoặc hình ảnh ba chiều. Kính hiển vi ánh sáng truyền thống là nguồn sáng trường dưới sự chụp ảnh một lần, các mẫu vật trên mỗi điểm của ảnh sẽ liền kề với điểm ánh sáng khúc xạ và giao thoa ánh sáng tán xạ. Độ rõ nét và chính xác của hai hình ảnh này không thể so sánh được.
4. Thu nhận, xử lý tín hiệu quang bằng máy tính và khuếch đại tín hiệu bằng ống nhân quang
Trong kính hiển vi đồng tiêu laser, máy tính thay thế mắt người hoặc máy ảnh để quan sát và quay video, đồng thời hình ảnh thu được sẽ được số hóa và có thể được xử lý trong máy tính để cải thiện độ rõ nét của hình ảnh một lần nữa. Hơn nữa, việc sử dụng ống nhân quang có thể khuếch đại tín hiệu rất yếu, cải thiện đáng kể độ nhạy. Nhờ việc sử dụng kết hợp các công nghệ trên, có thể nói LSCM là kính hiển vi tiên tiến nhất trên thế giới. Có thể nói LSCM là sự kết hợp giữa công nghệ sản xuất kính hiển vi, công nghệ quang điện, công nghệ máy tính**, là sản phẩm tất yếu của sự phát triển của công nghệ hiện đại.
