Nguyên tắc của kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang khác với kính hiển vi quang học thông thường. Thay vì quan sát mẫu vật dưới sự chiếu sáng của các nguồn sáng thông thường, họ sử dụng ánh sáng có bước sóng nhất định (thường là tia cực tím, ánh sáng xanh tím) để kích thích các chất huỳnh quang trong mẫu vật dưới kính hiển vi khiến chúng phát ra huỳnh quang. Do đó, Nguồn sáng của kính hiển vi huỳnh quang không có chức năng chiếu sáng trực tiếp mà là nguồn năng lượng kích thích các chất huỳnh quang trong mẫu vật. Lý do tại sao chúng ta có thể quan sát mẫu vật là do sự chiếu sáng của nguồn sáng, nhưng hiện tượng huỳnh quang xuất hiện sau khi chất huỳnh quang trong mẫu vật hấp thụ năng lượng ánh sáng kích thích.
Có thể thấy rằng đặc điểm của kính hiển vi huỳnh quang là nguồn sáng của nó có thể cung cấp một lượng lớn ánh sáng kích thích trong một dải bước sóng cụ thể, do đó chất huỳnh quang trong mẫu thử nghiệm có thể thu được ánh sáng kích thích ở cường độ cần thiết. Đồng thời, kính hiển vi huỳnh quang phải có hệ thống kính lọc tương ứng.
Kính hiển vi huỳnh quang là một công cụ thiết yếu trong hóa mô miễn dịch huỳnh quang. Nó bao gồm nguồn sáng điện áp cực cao, hệ thống lọc (bao gồm tấm lọc kích thích và triệt tiêu), hệ thống quang học và hệ thống chụp ảnh cùng các thành phần chính khác. Nó sử dụng ánh sáng có bước sóng nhất định để kích thích mẫu vật phát ra huỳnh quang.
Cách kích thích huỳnh quang: Theo dải bước sóng ánh sáng có thể chia làm hai loại: Phương pháp kích thích UV (dùng phương pháp chiếu tia cực tím) và phương pháp kích thích BV (dùng ánh sáng xanh tím). Phương pháp kích thích bằng tia cực tím sử dụng ánh sáng cận cực tím ngắn hơn 400nm để kích thích. Không có ánh sáng kích thích có thể nhìn thấy trong phương pháp này, vì vậy huỳnh quang quan sát được thể hiện huỳnh quang vốn có của thuốc nhuộm và dễ dàng phân biệt huỳnh quang cụ thể trên mẫu vật với sự tự phát huỳnh quang của mô nền.
Phương pháp kích thích BV dựa trên 404nm và 434nm để kích thích từ tia cực tím sang ánh sáng xanh lam. Phương pháp này sử dụng ánh sáng xanh lam để chiếu xạ mẫu vật, vì vậy bộ lọc cắt của hệ thống quan sát huỳnh quang phải sử dụng bộ lọc có thể chặn hoàn toàn ánh sáng xanh lam và truyền hoàn toàn huỳnh quang xanh lục và vàng cần thiết. Thuốc nhuộm huỳnh quang cho xét nghiệm kháng thể huỳnh quang. Bước sóng hấp thụ cực đại của ánh sáng kích thích tương đối gần với bước sóng phát xạ cực đại của huỳnh quang, vì vậy bộ lọc được sử dụng trong phương pháp kích thích BV phải sử dụng bộ lọc cắt sắc nét. Phương pháp này có thể sử dụng ánh sáng xanh lam làm ánh sáng kích thích, do đó hiệu suất hấp thụ của sắc tố huỳnh quang cao hơn và có thể thu được hình ảnh sáng hơn. Nhược điểm của nó là không thể nhìn thấy huỳnh quang dưới 500nm và huỳnh quang trên 500nm làm cho toàn bộ hình ảnh có màu vàng. Trong phương pháp kháng thể huỳnh quang, tính đặc hiệu của chất huỳnh quang thường được đánh giá bằng màu duy nhất của chất huỳnh quang. Do đó, khi thảo luận về tính đặc hiệu tinh tế, những thiếu sót nêu trên của phương pháp kích thích BV thường có ảnh hưởng lớn.
Tóm lại, độ chiếu sáng của kính hiển vi huỳnh quang có thể được xem xét theo ba điểm sau tùy theo cấu trúc của tụ quang và bước sóng của ánh sáng kích thích.
① Từ góc độ yêu cầu độ tương phản của hình ảnh huỳnh quang, bộ tập trung trường tối kích thích tia cực tím được sử dụng để chiếu sáng.
② Xem xét độ sáng của hình ảnh, bộ lọc kích thích BV có hiệu quả quan sát trường tối cao nhất.
③Các đặc điểm của quan sát trường tối của bộ lọc kích thích UV và chiếu sáng của bộ tập trung trường tối kích thích BV có thể được coi là nằm giữa hai phương pháp chiếu sáng này, nhưng phương pháp thứ nhất có đặc tính trường tối mạnh hơn và hiển thị hình ảnh sáng hơn. Độ tương phản nhỏ; cái sau giữ lại các thuộc tính của đường dẫn ánh sáng trường tối, do đó hình ảnh hiển thị tối hơn và độ tương phản được cải thiện. Khi thực sự sử dụng kính hiển vi huỳnh quang, nên sử dụng phương pháp chiếu sáng phù hợp nhất với yêu cầu của mẫu vật để quan sát.
Cần phải chỉ ra rằng ngay cả khi tụ quang trường tối kích thích bằng tia cực tím có độ tương phản tốt nhất được chiếu sáng, một phần ánh sáng kích thích bằng tia cực tím bị khúc xạ hoặc tán xạ bởi mẫu vật sẽ đi vào vật kính. Tự động phát huỳnh quang có thể làm xấu đi phản ứng hình ảnh. Do đó, phải sử dụng bộ lọc hấp thụ tia cực tím ở phía trước thị kính làm bộ lọc cắt.
