Nguyên lý và ứng dụng của kính hiển vi huỳnh quang
(1) Nguyên lý và đặc điểm cấu trúc của kính hiển vi huỳnh quang: kính hiển vi huỳnh quang sử dụng nguồn sáng điểm có hiệu suất phát sáng cao để phát ra ánh sáng có bước sóng nhất định (chẳng hạn như ánh sáng cực tím 3650 in hoặc ánh sáng xanh tím 4200 in) thông qua hệ thống lọc như ánh sáng kích thích để kích thích mẫu vật. Sau khi chất huỳnh quang bên trong phát ra huỳnh quang có nhiều màu sắc khác nhau, nó được quan sát thông qua độ phóng đại của vật kính và thị kính. Bằng cách này, dưới một nền tương phản mạnh, ngay cả khi huỳnh quang rất yếu, rất dễ xác định và có độ nhạy cao. Nó chủ yếu được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng tế bào và thành phần hóa học. Cấu trúc cơ bản của kính hiển vi huỳnh quang bao gồm kính hiển vi quang học thông thường cộng với một số phụ kiện (chẳng hạn như nguồn sáng huỳnh quang, bộ lọc kích thích, bộ tách chùm tia hai màu và bộ lọc chặn, v.v.). Nguồn sáng huỳnh quang - thường sử dụng đèn thủy ngân siêu cao áp (50-200W), có thể phát ra ánh sáng có nhiều bước sóng khác nhau, nhưng mỗi chất huỳnh quang có một bước sóng kích thích tạo ra huỳnh quang mạnh nhất, nên cần thêm một bộ lọc kích thích ( Nói chung, có các bộ lọc kích thích tia cực tím, tím, xanh lam và xanh lục), chỉ cho phép ánh sáng kích thích có bước sóng nhất định đi qua và chiếu xạ mẫu vật, đồng thời hấp thụ ánh sáng khác. Sau khi mỗi chất được chiếu xạ bằng ánh sáng kích thích, nó sẽ phát ra huỳnh quang nhìn thấy được với bước sóng dài hơn bước sóng chiếu xạ trong thời gian rất ngắn. Huỳnh quang là cụ thể và thường yếu hơn ánh sáng kích thích. Để quan sát huỳnh quang cụ thể, cần có bộ lọc chặn (hoặc triệt tiêu) phía sau vật kính. Nó có hai chức năng: một là hấp thụ và chặn ánh sáng kích thích đi vào thị kính, để không làm nhiễu huỳnh quang và làm hỏng mắt; cách khác là chọn và cho huỳnh quang cụ thể đi qua, hiển thị một màu huỳnh quang cụ thể. Hai bộ lọc phải được sử dụng cùng nhau.
Có hai loại kính hiển vi huỳnh quang xét về đường quang học của chúng:
1. Kính hiển vi huỳnh quang truyền qua: Nguồn sáng kích thích kích thích huỳnh quang xuyên qua vật liệu tiêu bản thông qua thấu kính hội tụ. Bộ thu trường tối thường được sử dụng và bộ thu thông thường cũng có thể được sử dụng để điều chỉnh gương sao cho ánh sáng kích thích được truyền và đi vòng qua mẫu vật. Đây là một kính hiển vi huỳnh quang kiểu cũ. Ưu điểm là huỳnh quang mạnh ở độ phóng đại thấp và nhược điểm là huỳnh quang giảm khi độ phóng đại tăng. Do đó, tốt hơn là quan sát các vật liệu mẫu vật lớn hơn.
2. Kính hiển vi huỳnh quang Epi Đây là một loại kính hiển vi huỳnh quang mới được phát triển trong thời hiện đại. Sự khác biệt là ánh sáng kích thích rơi từ vật kính đến bề mặt của mẫu vật, nghĩa là, cùng một vật kính được sử dụng làm tụ quang và vật kính để thu thập huỳnh quang. Một bộ tách chùm lưỡng sắc cần được thêm vào đường đi của ánh sáng, cách urani nhẹ 45 độ. Ánh sáng kích thích được phản xạ vào vật kính và được thu thập trên mẫu. Huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu và ánh sáng kích thích được phản xạ bởi bề mặt thấu kính của vật kính và bề mặt kính che đi vào thấu kính vật kính cùng một lúc và quay trở lại bộ tách chùm hai màu để làm cho ánh sáng kích thích được tách ra khỏi huỳnh quang , ánh sáng kích thích còn lại được hấp thụ bởi các bộ lọc chặn. Nếu bạn chuyển sang kết hợp các bộ lọc kích thích/bộ tách chùm tia hai màu/bộ lọc chặn khác nhau, thì có thể đáp ứng nhu cầu về các sản phẩm phản ứng huỳnh quang khác nhau. Ưu điểm của loại kính hiển vi huỳnh quang này là sự chiếu sáng của trường nhìn đồng đều, hình ảnh rõ nét và độ phóng đại càng lớn thì huỳnh quang càng mạnh.
(2) Cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang.
1. Bật nguồn sáng, đèn thủy ngân siêu cao áp cần khởi động vài phút để đạt điểm sáng nhất.
2. Đối với kính hiển vi huỳnh quang truyền qua, nên lắp đặt bộ lọc kích thích cần thiết giữa nguồn sáng và bộ ngưng tụ, và bộ lọc chặn tương ứng phải được lắp đặt phía sau vật kính. Kính hiển vi huỳnh quang epi cần phải chèn bộ lọc kích thích/bộ tách chùm tia màu kép/bộ lọc chặn cần thiết vào các khe trong đường đi của ánh sáng.
3. Quan sát bằng thấu kính có độ phóng đại thấp và điều chỉnh tâm của nguồn sáng theo thiết bị điều chỉnh của các loại kính hiển vi huỳnh quang khác nhau sao cho nó nằm ở tâm của toàn bộ điểm chiếu sáng.
4. Đặt tấm tiêu bản và quan sát sau khi lấy nét. Cần chú ý trong quá trình sử dụng: Không quan sát trực tiếp với bộ lọc cuối, để không gây hại cho mắt; khi quan sát tiêu bản bằng thấu kính dầu, phải sử dụng thấu kính dầu chuyên dụng không có huỳnh quang; sau khi tắt đèn thủy ngân cao áp, không thể bật lại ngay mà cần phải kiểm tra. Nó có thể được khởi động lại sau 5 phút, nếu không nó sẽ không ổn định và ảnh hưởng đến tuổi thọ của đèn thủy ngân.
(3) Quan sát Sử dụng bộ lọc ánh sáng xanh tím dưới kính hiển vi huỳnh quang trên nền tảng giảng dạy, có thể thấy rằng các tế bào được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang màu cam acridine o,01 phần trăm, nhân và tế bào chất bị kích thích tạo ra hai màu khác nhau của huỳnh quang (tối) xanh lục và đỏ cam).
