Hình ảnh kính hiển vi đa điểm: các kỹ thuật đa dạng để chụp ảnh tế bào thần kinh trong cơ thể
So với kính hiển vi huỳnh quang trường rộng đơn photon truyền thống, kính hiển vi đa photon (MPM) có chức năng cắt quang học và chụp ảnh sâu. Năm 2019, Jerome Lecoq và cộng sự. đã thảo luận về công nghệ MPM liên quan từ ba khía cạnh: chụp ảnh nơ-ron sâu trong não, chụp ảnh nơ-ron lớn và chụp ảnh nơ-ron tốc độ cao.
Để liên kết hoạt động của nơ-ron với hành vi phức tạp, thông thường cần phải chụp ảnh các nơ-ron ở vỏ não sâu, điều này đòi hỏi MPM phải có khả năng chụp ảnh sâu. Ánh sáng kích thích và phát xạ sẽ bị mô sinh học phân tán và hấp thụ ở mức độ cao, đây là yếu tố chính hạn chế độ sâu hình ảnh của MPM. Mặc dù vấn đề tán xạ có thể được giải quyết bằng cách tăng cường độ laser, nhưng nó sẽ gây ra các vấn đề khác, chẳng hạn như làm cháy mẫu, làm lệch tiêu điểm và kích thích huỳnh quang gần bề mặt. Cách tốt nhất để tăng độ sâu của hình ảnh MPM là sử dụng các bước sóng dài hơn làm ánh sáng kích thích.
Ngoài ra, đối với hình ảnh hai photon (2P), kích thích huỳnh quang ngoài tiêu điểm và gần bề mặt là hai yếu tố hạn chế độ sâu lớn nhất, trong khi đối với hình ảnh ba photon (3P), hai vấn đề này được giảm đáng kể, nhưng tạo ảnh ba photon do huỳnh quang Tiết diện hấp thụ của nhóm nhỏ hơn nhiều so với tiết diện của 2P, do đó, cần có năng lượng xung có cường độ cao hơn để thu được tín hiệu huỳnh quang có cùng cường độ như tín hiệu được kích thích bởi 2P. Kính hiển vi 3P chức năng đòi hỏi khắt khe hơn so với kính hiển vi 3P cấu trúc, yêu cầu quét nhanh hơn để lấy mẫu hoạt động của tế bào thần kinh kịp thời; cần có năng lượng xung cao hơn để thu thập đủ tín hiệu trong thời gian dừng của mỗi pixel.
Các hành vi phức tạp thường liên quan đến các mạng não lớn với cả kết nối cục bộ và tầm xa. Để liên kết hoạt động của nơ-ron với hành vi, cần phải theo dõi hoạt động của các nơ-ron rất lớn và phân bố rộng rãi cùng một lúc. Mạng thần kinh trong não xử lý các kích thích đến trong vòng hàng chục phần nghìn giây. Để hiểu được mạng nơ-ron nhanh này Để nghiên cứu động lực học nơ-ron, MPM cần phải có khả năng chụp ảnh nơ-ron nhanh chóng. Các phương pháp MPM nhanh có thể được chia thành kỹ thuật quét đơn tia và kỹ thuật quét đa tia.
Công nghệ quét chùm tia đơn cho phép quét mô thần kinh tốc độ cao với trường quan sát (FOV) lớn
Khi sử dụng MPM để chụp ảnh các nơ-ron, tính năng quét truy cập ngẫu nhiên—nghĩa là chùm tia laze được quét nhanh tại bất kỳ điểm đã chọn nào trên toàn bộ trường quan sát—chỉ có thể quét các nơ-ron quan tâm, điều này không chỉ tránh quét bất kỳ sợi thần kinh nào không được gắn nhãn mà còn có thể đồng thời tối ưu hóa thời gian quét của chùm tia laze. Có thể thực hiện quét truy cập ngẫu nhiên (Hình 1) bằng bộ làm lệch hướng âm thanh (AOD), hoạt động bằng cách liên kết một bộ chuyển đổi áp điện với tín hiệu tần số vô tuyến với một tinh thể phù hợp. Sóng âm thu được tạo ra một cách tử chiết suất tuần hoàn, Hiện tượng nhiễu xạ xảy ra khi một chùm tia laze đi qua một cách tử. Cường độ và tần số của sóng âm thanh có thể được điều chỉnh bằng tín hiệu điện tần số vô tuyến để thay đổi cường độ và hướng của ánh sáng nhiễu xạ, để có thể thực hiện quét điểm tùy ý theo chiều ngang một chiều bằng cách sử dụng một AOD và có thể nhận ra 3D bằng cách sử dụng một cặp AOD kết hợp với các công nghệ quét theo trục khác, quét truy cập ngẫu nhiên. Tuy nhiên, kỹ thuật này rất nhạy cảm với chuyển động của mẫu và dễ bị tạo tác chuyển động. Hiện tại, quét raster nhanh, nghĩa là quét lũy tiến trong FOV, được sử dụng rộng rãi vì thuật toán có thể dễ dàng giải quyết các tạo tác chuyển động.
Hình ảnh hai photon dựa trên AOD của tế bào thần kinh L2/3 tân vỏ não in vivo[2]
Có nhiều cách để thực hiện quét raster nhanh, sử dụng gương rung để quét 2D nhanh, kết hợp gương rung và thấu kính điện có thể điều chỉnh để quét 3D nhanh, nhưng thấu kính điện có thể điều chỉnh không thể lấy nét nhanh theo hướng trục do giới hạn của Chuyển đổi quán tính cơ học, ảnh hưởng đến tốc độ hình ảnh, giờ đây có thể được thay thế bằng bộ điều chế ánh sáng không gian (SLM).
Lấy nét từ xa cũng là một phương tiện để đạt được hình ảnh 3D, như trong Hình 2. Trong mô-đun LSU, điện kế quét quét theo chiều ngang và mô-đun ASU bao gồm vật kính L1 và gương M, và quá trình quét dọc trục được thực hiện bằng cách điều chỉnh vị trí của M. Kỹ thuật này không chỉ có thể hiệu chỉnh quang sai do thấu kính vật kính chính L2 gây ra mà còn cho phép quét dọc trục nhanh chóng. Để thu được nhiều hình ảnh nơ-ron hơn, FOV có thể được phóng to bằng cách điều chỉnh thiết kế vật kính của kính hiển vi, nhưng vật kính có NA lớn và FOV lớn thường nặng và không thể di chuyển nhanh để quét dọc trục nhanh, vì vậy các hệ thống FOV lớn dựa vào Lấy nét từ xa , SLM và ống kính cơ giới có thể điều chỉnh.
Sơ đồ hệ thống chụp ảnh hai photon lấy nét từ xa[3] Công nghệ quét đa tia có thể chụp ảnh đồng thời các vị trí khác nhau của mô thần kinh
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>các vị trí hình ảnh 1-2 mm) (Hình 3C, D); đối với các vùng liền kề, nó thường sử dụng nhiều chùm tia của một vật kính duy nhất để chụp ảnh (Hình 3E, F). Kỹ thuật quét đa chùm phải đặc biệt chú ý đến vấn đề nhiễu xuyên âm giữa các chùm kích thích, vấn đề này có thể được giải quyết bằng phương pháp tách nguồn sáng sau hoặc phương pháp ghép kênh không-thời gian. Phương pháp tách nguồn sáng post-hoc đề cập đến việc sử dụng các thuật toán để tách các chùm tia nhằm loại bỏ nhiễu xuyên âm; phương pháp ghép kênh thời gian-không gian đề cập đến việc sử dụng đồng thời nhiều chùm kích thích, các xung của từng chùm bị trễ theo thời gian, do đó có thể tạm thời tách các chùm riêng lẻ được kích thích bởi các chùm khác nhau. tín hiệu huỳnh quang. Nhiều tế bào thần kinh hơn có thể được chụp ảnh bằng cách đưa vào nhiều chùm tia hơn, nhưng nhiều chùm tia sẽ làm tăng thời gian phân rã huỳnh quang trùng lặp, làm hạn chế khả năng phân biệt các nguồn tín hiệu; và ghép kênh có tác động tiêu cực đến tốc độ làm việc của các thiết bị điện tử. Yêu cầu cao; một số lượng lớn chùm tia cũng đòi hỏi công suất laser cao hơn để duy trì tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu gần đúng của một chùm tia đơn lẻ, điều này có thể dễ dàng dẫn đến tổn thương mô.
Công nghệ hình ảnh diện tích lớn
Trong những năm gần đây, sự phát triển của các công nghệ MPM khác nhau đã mở rộng phạm vi chụp ảnh mô thần kinh của chúng ta, cho phép chúng ta chụp ảnh nhiều tế bào thần kinh sâu hơn trong não với tốc độ nhanh hơn, điều này đã thúc đẩy mạnh mẽ nghiên cứu khoa học thần kinh và giúp chúng ta hiểu rõ hơn của chức năng não bộ.
