Lớp học hình ảnh hiển vi丨Ứng dụng của kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (TIRFM) là một kỹ thuật sử dụng sóng biến thiên được tạo ra bởi một chùm ánh sáng truyền giữa hai môi trường có chỉ số khúc xạ khác nhau để thăm dò bề mặt của các tế bào sống được dán nhãn huỳnh quang. Trong thực tế, khi một chùm tia laser tới gặp giao diện giữa lớp phủ và môi trường nước chứa các tế bào, nó bị phản xạ ở góc tới hạn (phản xạ toàn phần bên trong). Do năng lượng của sóng biến đổi giảm theo cấp số nhân với khoảng cách từ lớp phủ, chỉ các chất phát huỳnh quang trong phạm vi 10 nanomet của bề mặt (từ 10 đến 200 nanomet) bị kích thích bởi sóng biến đổi khí, trong khi các chất phát huỳnh quang ở xa hơn phần lớn không bị kích thích. Ảnh hưởng. Do đó, TIRFM dẫn đến mức tín hiệu cao từ các huỳnh quang nằm gần lớp phủ, được đặt chồng lên nhau trên nền rất tối, mang lại tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm tuyệt vời. Giới hạn cực độ của độ sâu kích thích là lý tưởng để nghiên cứu các phân tử đơn lẻ hoặc thành phần màng và cơ quan trong các tế bào kết dính gần bề mặt lớp phủ (xem Hình 8(e)). Vì sự kích thích bị hạn chế ở những vùng mỏng gần lớp phủ, nên quá trình tẩy trắng và độc tính quang cũng bị hạn chế ở những vùng này, khiến TIRFM trở thành một trong những phương pháp hữu ích nhất để quan sát lâu dài. Kỹ thuật này đã trở thành một công cụ cơ bản để nghiên cứu một loạt các hiện tượng trong tế bào và sinh học phân tử.
Giải chập là một thuật toán được áp dụng cho một tập hợp các hình ảnh lấy nét đều thu được dọc theo trục quang học (Z) để tăng cường tín hiệu photon trong một chồng hình ảnh cho một mặt phẳng hình ảnh nhất định hoặc nhiều mặt phẳng tiêu điểm. Kính hiển vi phải được trang bị bộ truyền động lấy nét cơ giới có độ chính xác cao để đảm bảo thu được hình ảnh ở các khoảng được xác định chính xác giữa các mặt phẳng tiêu điểm của mẫu. Trong một ứng dụng điển hình (xem Hình 8(f)), quy trình giải chập được sử dụng để làm mờ và loại bỏ ánh sáng nằm ngoài tiêu cự khỏi một mặt phẳng tiêu cự nhất định bằng cách sử dụng kích thích và phát xạ huỳnh quang trường rộng. Ứng dụng phức tạp nhất là áp dụng quy trình giải chập cho toàn bộ ngăn xếp hình ảnh để tạo các chế độ xem hoặc mô hình 3D được chiếu. Một tập hợp các hình ảnh trường rộng được sử dụng để giải mã sẽ ghi lại số lượng photon tối đa theo lý thuyết mà mẫu phát ra. Quá trình giải chập phân phối lại cường độ "mờ" của các photon phát ra bên trên và bên dưới mặt phẳng tiêu cự trở lại mặt phẳng ban đầu. Do đó, giải chập sử dụng gần như tất cả các cường độ phát xạ có sẵn và cung cấp ngân sách ánh sáng tối ưu, làm cho kỹ thuật này trở thành phương pháp được lựa chọn cho các mẫu rất nhạy cảm với ánh sáng.
Một biến thể của hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng trên kính hiển vi huỳnh quang, huỳnh quang hoặc truyền năng lượng cộng hưởng Forster (FRET) được sử dụng để thu được thông tin định lượng về thời gian và không gian về sự liên kết và tương tác của protein, lipid, enzym và axit nucleic trong tế bào sống. FRET có thể sử dụng các kỹ thuật trạng thái không đổi hoặc giải quyết theo thời gian, nhưng hình ảnh FRET được giải quyết theo thời gian có lợi thế là ánh xạ chính xác hơn khoảng cách của người cho-người nhận. Một kính hiển vi huỳnh quang trường rộng tiêu chuẩn được trang bị các bộ lọc kích thích và phát xạ thích hợp và một máy ảnh nhạy cảm có thể được sử dụng để tạo ảnh FRET. Các cảm biến sinh học kẹp một protein hoặc peptide nhạy cảm với môi trường giữa hai protein huỳnh quang có thể áp dụng FRET hiện đang được sử dụng rộng rãi trong sinh học tế bào. Những đầu dò này dễ dàng được chụp ảnh dưới kính hiển vi huỳnh quang trường rộng bằng cách sử dụng các kỹ thuật FRET phát xạ nhạy cảm kết hợp với phân tích đo lường. Ngoài ra, hình ảnh quang phổ và tách tuyến tính bằng kính hiển vi đồng tiêu quét laser có thể giúp theo dõi hiện tượng FRET trong cảm biến sinh học và các ứng dụng protein huỳnh quang khác.
Kính hiển vi hình ảnh thời gian sống huỳnh quang (FLIM) là một kỹ thuật tinh vi có khả năng ghi lại đồng thời thời gian sống huỳnh quang và vị trí không gian của chất huỳnh quang tại mọi vị trí trong ảnh. Phương pháp này cung cấp một cơ chế để nghiên cứu các thông số môi trường như pH, nồng độ ion, độ phân cực của dung môi, tương tác không cộng hóa trị, độ nhớt và sức căng oxy trong các tế bào sống đơn lẻ và trình bày dữ liệu theo mảng không gian và thời gian. Các phép đo FLIM về thời gian tồn tại ở trạng thái kích thích trên thang nano giây không phụ thuộc vào nồng độ fluorophore cục bộ, hiệu ứng tẩy trắng quang hóa và độ dài đường truyền (độ dày mẫu), nhưng nhạy cảm với các phản ứng ở trạng thái kích thích như truyền năng lượng cộng hưởng. Trên thực tế, việc kết hợp FLIM với FRET bằng cách theo dõi sự thay đổi tuổi thọ của các nhà tài trợ huỳnh quang trước và sau khi truyền năng lượng cộng hưởng được coi là một trong những cách tốt nhất để nghiên cứu hiện tượng này.
Độ linh động (hệ số khuếch tán ngang) của các đại phân tử được đánh dấu huỳnh quang và các chất phát huỳnh quang nhỏ có thể được xác định bằng kỹ thuật phục hồi huỳnh quang sau khi tẩy trắng bằng quang hóa (FRAP). Trong FRAP, một khu vực được chọn rất nhỏ (đường kính vài micromet) được chiếu sáng mạnh, thường là bằng tia laze, để tạo ra quá trình tẩy trắng hoàn toàn bằng fluorophore trong khu vực đó. Kết quả là làm giảm đáng kể hoặc triệt tiêu huỳnh quang. Sau một xung tẩy trắng, tốc độ và mức độ phục hồi cường độ huỳnh quang ở các vùng được tẩy trắng được theo dõi như là một hàm của thời gian ở cường độ kích thích thấp để tạo ra thông tin về động học của quá trình tái tạo và phục hồi chất huỳnh quang (Hình 9). FRAP thường được thực hiện bằng cách sử dụng EGFP hoặc các protein huỳnh quang khác. Các kỹ thuật kích hoạt quang liên quan dựa trên các chất phát huỳnh quang có lồng tổng hợp đặc biệt hoặc các protein huỳnh quang có chức năng tương tự có thể được kích hoạt bằng các xung tia cực tím hoặc tia cực tím ngắn. Kích hoạt quang và FRAP có thể được sử dụng như các kỹ thuật bổ sung để xác định các thông số di động.
Trong một kỹ thuật liên quan đến FRAP, được gọi là hiện tượng mất huỳnh quang sau quá trình tẩy trắng bằng quang hóa (FLIP), một vùng huỳnh quang xác định trong một tế bào sống trải qua quá trình tẩy trắng lặp đi lặp lại bằng bức xạ cường độ cao. Nếu tất cả các chất huỳnh quang có thể khuếch tán vào khu vực được tẩy trắng quang hóa trong khoảng thời gian đo được, thì điều này sẽ dẫn đến mất hoàn toàn tín hiệu huỳnh quang trong toàn bộ tế bào. Bằng cách tính toán tốc độ huỳnh quang biến mất khỏi toàn bộ tế bào, có thể xác định được độ linh động khuếch tán của chất huỳnh quang mục tiêu. Ngoài ra, FLIP có thể dễ dàng xác định vị trí và bản chất của bất kỳ rào cản khuếch tán nào giữa các ngăn riêng lẻ của tế bào, chẳng hạn như rào cản giữa soma và sợi trục của nơ-ron.
Quang phổ tương quan huỳnh quang (FCS), chủ yếu được sử dụng trong kính hiển vi đồng tiêu quét laser hoặc kính hiển vi đa điểm, là một phương pháp được thiết kế để xác định thông tin động học như tốc độ phản ứng hóa học, hệ số khuếch tán, kỹ thuật cho trọng lượng phân tử, tốc độ dòng chảy và tập hợp. Trong FCS, một thể tích nhỏ (xấp xỉ một femto kế; tiêu cự giới hạn nhiễu xạ của laze) được chiếu sáng bằng một chùm laze hội tụ để ghi lại các dao động cường độ tự phát huỳnh quang do động lực học của các phân tử huỳnh quang gây ra như là một hàm của thời gian trong thể tích bị huỳnh quang chiếm giữ. phân tử (Hình 10). Các huỳnh quang tương đối nhỏ khuếch tán nhanh chóng trong thể tích được chiếu sáng, tạo ra các đợt bùng phát ngắn với cường độ ngẫu nhiên. Ngược lại, các phức chất lớn hơn (các chất huỳnh quang liên kết với các đại phân tử) di chuyển chậm hơn, tạo ra các mẫu cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thời gian lâu hơn, bền bỉ hơn.
Khi các cấu trúc được dán nhãn huỳnh quang dày đặc và chồng lên nhau trong các vùng cụ thể của tế bào sống, thì động lực học và sự phân bố không gian của chúng rất khó phân tích. Kính hiển vi điểm huỳnh quang (FSM) là một kỹ thuật tương thích với hầu hết các phương thức hình ảnh, tận dụng nồng độ rất thấp của các tiểu đơn vị được dán nhãn huỳnh quang, làm giảm huỳnh quang ngoài tiêu điểm và cải thiện khả năng hiển thị của các cấu trúc được dán nhãn và động lực học của chúng ở các vùng dày. FSM được thực hiện bằng cách chỉ dán nhãn một phần của toàn bộ cấu trúc quan tâm. Theo nghĩa này, FSM tương tự như việc thực hiện FCS trên toàn bộ trường nhìn, mặc dù nó nhấn mạnh hơn vào các mẫu không gian hơn là phân tích thời gian định lượng. Kính hiển vi điểm huỳnh quang đặc biệt hữu ích trong việc xác định tính di động và tập hợp của các yếu tố tế bào như actin và vi ống trong các tế bào hiếu động.
Kính hiển vi suy giảm phát xạ kích thích (STED) là một kỹ thuật siêu phân giải mới nổi với độ phân giải không gian vượt xa giới hạn nhiễu xạ, sử dụng ánh sáng suy giảm hình vòng để bao quanh một chùm ánh sáng kích thích nhỏ hơn nhằm thu được sub-50nm trên trục để độ phân giải. Kỹ thuật này dựa trên sự kích thích của chất huỳnh quang với các xung laze được đồng bộ hóa và các xung STED hình tròn được phối hợp theo không gian làm cạn kiệt ánh sáng phát ra, ngăn chặn sự phát huỳnh quang của các phân tử bị kích thích xung quanh tiêu điểm quét laze. Huỳnh quang được tạo ra ở ngoại vi của vết bị triệt tiêu, nhưng không ở trung tâm của vết, do đó làm giảm đáng kể kích thước của vết huỳnh quang và tương ứng làm tăng đáng kể độ phân giải. STED đã được chứng minh là một công cụ hữu ích để phát hiện tế bào sống với độ phân giải cao. Các kỹ thuật siêu phân giải mới nổi khác, chẳng hạn như kính hiển vi định vị quang hóa (PALM) và kính hiển vi chiếu sáng bằng ánh sáng có cấu trúc (SIM), cũng sẽ trở thành công cụ cơ bản để chụp ảnh tế bào sống trong tương lai gần.
Việc sử dụng ngày càng nhiều các protein huỳnh quang được mã hóa di truyền và fluorophores tổng hợp tiên tiến để chụp ảnh tế bào sống mở ra cơ hội cho các phương thức quang học mới để theo dõi động lực học tạm thời và các mối quan hệ không gian. Các nhà kính hiển vi hiện có một bộ công cụ hoàn chỉnh để quan sát và ghi lại dữ liệu hình ảnh của các quá trình tế bào xảy ra trong một khoảng thời gian rộng và ở nhiều độ phân giải. Có thể dễ dàng quan sát và ghi lại các sự kiện chậm hơn bằng kính hiển vi đồng tiêu quét laze, trong khi các sự kiện động học nhanh hơn có thể thu được bằng công nghệ đĩa quay. Ngoài ra, kính hiển vi đa điểm cho phép chụp ảnh sâu trong các mô dày và kỹ thuật phản xạ toàn phần bên trong cho phép thăm dò các bề mặt màng với độ chính xác đồng tiêu. Các phương pháp huỳnh quang tiên tiến, chẳng hạn như FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM và STED, có thể được sử dụng để theo dõi các tương tác protein-protein ở độ phân giải thường tốt hơn so với độ phân giải cho phép bởi giới hạn nhiễu xạ. Với những tiến bộ trong công nghệ huỳnh quang, kính hiển vi và máy dò, một thế giới rộng lớn hơn sẽ được đưa "dưới kính hiển vi".
