Phương pháp mở rộng độ sâu tiêu cự của kính hiển vi đa photon
Sự kết hợp giữa hai-kính hiển vi quét laser photon và chỉ báo canxi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện tín hiệu thần kinh trong cơ thể sống. Các nơ-ron trong mạng nơ-ron được phân bổ trong không gian ba{2} chiều và việc theo dõi động thái hoạt động của chúng đòi hỏi một cách để nhanh chóng cải thiện tốc độ chụp ảnh khối. Tuy nhiên, bằng cách sử dụng kính hiển vi đa photon quét cách tử để chụp ảnh một số lượng lớn hình ảnh, nếu sử dụng vật kính có khẩu độ số (NA) cao để đạt được độ phân giải ngang cao hơn thì sẽ dẫn đến độ sâu tiêu cự nhỏ hơn. Để thu được hình ảnh khối ở độ sâu tiêu cự nhỏ,
Cần thực hiện quét trục Z-thông qua một số phương tiện, chụp ảnh nhiều mặt phẳng bằng cách quét từng mặt phẳng tiêu cự, điều này hạn chế đáng kể tốc độ chụp ảnh. Nếu thông tin hình ảnh trục có thể được loại bỏ và có thể đạt được chức năng quét khối trong một lần quét bên bằng cách mở rộng độ sâu tiêu điểm, nghĩa là thông tin khối được chiếu lên một hình ảnh 2D duy nhất, thì tốc độ hình ảnh có thể được cải thiện đáng kể. Đây được gọi là hình ảnh Độ sâu tiêu điểm mở rộng (EDF), đặc biệt hữu ích để chụp ảnh các cấu trúc dân số thưa thớt đòi hỏi độ phân giải thời gian cao, chẳng hạn như hình ảnh chức năng của hoạt động thần kinh.
Độ phân giải dọc trục và ngang của kính hiển vi được xác định bởi khẩu độ số (NA) của vật kính. NA cao có thể tối đa hóa độ phân giải dọc trục và ngang cũng như lượng ánh sáng thu được; NA thấp hơn sẽ dẫn đến độ phân giải dọc trục thấp hơn, tức là độ sâu tiêu cự dài hơn, nhưng đồng thời phải hy sinh độ phân giải ngang và hiệu quả thu ánh sáng. Phương pháp mở rộng độ sâu tiêu điểm sẽ được giới thiệu tiếp theo có thể đạt được điều này trong khi vẫn duy trì độ phân giải ngang cao và lượng ánh sáng đủ.
Việc sử dụng bộ điều biến ánh sáng không gian để tạo ra chùm Bessel mảnh tiêu cự có thể đạt được hình ảnh EDF, nhưng bộ điều biến ánh sáng không gian cồng kềnh và khó tương thích với không gian kính hiển vi hẹp; Ngược lại, các mô-đun Bessel dựa trên kim tự tháp trục có giá thành rẻ và nhỏ gọn nhưng chúng chỉ có thể tạo ra các tiêu điểm có độ sâu cố định và không phù hợp với các thí nghiệm khác nhau yêu cầu thay đổi liên tục về độ sâu tiêu cự. Để giải quyết vấn đề này, năm 2018, RONGWEN LU et al. đã trình diễn một mô-đun Bessel dựa trên một trục, trong đó chỉ cần dịch một thấu kính dọc theo trục quang để liên tục điều chỉnh độ dài trục của tiêu điểm Bessel.
Hình 1 (a) Sơ đồ thiết bị mô-đun Bessel; (b) Hàm trải rộng điểm được đo bằng thực nghiệm khi D lần lượt là -12 mm, 0 mm và 12 mm; (c) Mối quan hệ giữa toàn bộ chiều rộng bên ở mức tối đa một nửa, (d) toàn bộ chiều rộng trục ở mức tối đa một nửa, (e) tín hiệu cực đại và (f) công suất quang phía sau thấu kính vật kính có độ dịch chuyển L2 D
Thiết bị mô-đun để hình thành tiêu điểm Bessel có chiều dài thay đổi được hiển thị trong Hình 1a. Chùm tia Gauss tới được định hình thành chùm tia tròn sau khi đi qua trục và thấu kính L1. Mặt nạ khẩu độ hình tròn tiếp theo có thể chặn ánh sáng đi lạc do khuyết tật axicon gây ra, từ đó định hình sự phân bố theo trục của hàm trải rộng điểm kích thích hai-photon. Sau đó, chùm ánh sáng được chiếu lên điện kế bằng thấu kính L2 và L3, rồi đi tới mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính thông qua thấu kính L4 và L5.
Những thiết kế này tương tự như các mô-đun dựa trên kim tự tháp truyền thống, với điểm khác biệt là bằng cách di chuyển L2 hoặc L3 dọc theo trục quang, độ dài trục của tiêu điểm Bessel có thể được điều chỉnh liên tục. Hình 1b hiển thị các hàm trải rộng điểm trục cho các giá trị D là -12 mm, 0 mm và 12 mm, với toàn bộ chiều rộng trục ở mức tối đa một nửa là 39? tôi, 24? M và 14? m. Như minh họa trong Hình 1c-f, việc di chuyển thấu kính L2 từ trái sang phải có thể liên tục thay đổi toàn bộ chiều rộng ở mức tối đa một nửa theo cả hướng ngang và hướng trục, có nghĩa là độ sâu tiêu cự có thể thay đổi liên tục. Các kết quả mô phỏng số dựa trên lý thuyết nhiễu xạ vectơ phù hợp tốt với dữ liệu thực nghiệm. Hình 2 xác minh hiệu quả hiệu chỉnh của các mặt nạ hình khuyên có kích thước khác nhau đối với các khuyết tật của trục. Người ta nhận thấy rằng mặt nạ hình khuyên mỏng hơn có thể tối ưu hóa tốt hơn sự phân bổ cường độ dọc trục của chùm Bessel đầu ra, nhưng đồng thời, chúng cũng dẫn đến tổn thất điện năng nhiều hơn.
