Kính hiển vi đồng tiêu Laser - Tính năng và ứng dụng
Kính hiển vi đồng tiêu quét laser (LSCM) là loại kính hiển vi được thiết kế dựa trên công nghệ hội tụ liên hợp, tức là nguồn sáng laser, mẫu cần đo và đầu dò đều ở vị trí liên hợp với nhau.
Cơ bản
Trong kính hiển vi thông thường, mặt phẳng ảnh quan sát được cách ly với mặt phẳng trục liền kề bằng cách trùng mặt phẳng tiêu cự của vật kính với máy dò, trong khi ở kính hiển vi đồng tiêu, một điểm sáng giới hạn nhiễu xạ được sử dụng để chiếu sáng mẫu và A lỗ kim được sử dụng trong đường dẫn ánh sáng thu thập tại tiêu điểm liên hợp của điểm sáng để lọc ánh sáng lạc nhằm tạo ra hiệu ứng cách ly này và nhờ đó cải thiện độ phân giải.
Tính năng hình ảnh
Hình ảnh quét phần quang học
Một tính năng khác của kính hiển vi đồng tiêu quét laser là nó là công nghệ quét hình ảnh. Công nghệ chiếu sáng trường rộng truyền thống chiếu sáng toàn bộ mẫu nên hình ảnh có thể được chụp trực tiếp bằng mắt thường hoặc máy dò nhưng LSCM sử dụng một chùm tia hoặc nhiều chùm tia hội tụ đi qua mẫu để quét và chụp ảnh. Hình ảnh thu được được gọi là phần quang học. Phần sau đây cho thấy sự khác biệt giữa phương pháp chiếu sáng trường rộng truyền thống và phương pháp chiếu sáng đồng tiêu quét laser.
Do đó, phương pháp làm việc thực tế của kính hiển vi đồng tiêu hiện đại được thể hiện trong hình bên dưới. Ánh sáng kích thích do tia laser phát ra đi qua gương lưỡng sắc và được quét theo hướng x và hướng y của mẫu thông qua một cặp điện kế. Sự kích thích (hoặc phản xạ) của mẫu là Ánh sáng đi vào máy dò PMT qua lỗ kim và được ghi lại, đồng thời hình ảnh quét được ghi lại sẽ được máy tính tái tạo lại để tái tạo lại hình ảnh mẫu thực tế.
Tạo hình ảnh "z-stack" trên các mặt phẳng tiêu cự khác nhau
Chỉ ánh sáng phản xạ trở lại từ lớp mẫu liên hợp mới có thể đi qua lỗ nhỏ trên đường dẫn ánh sáng của bộ sưu tập và các phản xạ của lớp mẫu không liên quan còn lại sẽ bị lỗ nhỏ chặn lại. Điều này có thể dẫn đến cải thiện độ phân giải đáng kể. So sánh song song giữa kính hiển vi huỳnh quang đa chiều và kính hiển vi đồng tiêu của cùng một mẫu dày. Khi một loạt hình ảnh được chụp ở các mặt phẳng tiêu điểm khác nhau, các hình ảnh thường được gọi là "ngăn xếp z" có thể được tạo ra, minh họa độ phân giải và độ tương phản được cung cấp bởi kính hiển vi đồng tiêu và nguyên nhân cơ bản của những lợi ích này. Có thể thấy rằng việc kiểm tra hình ảnh ở đầu ngăn xếp với mặt phẳng hình ảnh phía trên mô cho thấy một lượng lớn ánh sáng tán xạ trong hình ảnh huỳnh quang, trong khi hình ảnh kính hiển vi đồng tiêu xuất hiện màu đen. Việc giảm PSF dọc trục này trực tiếp dẫn đến chênh lệch độ phân giải quan sát được tại giao diện quang ở giữa ngăn xếp z.
Độ phân giải được cải thiện rất nhiều so với chiếu sáng trường rộng
Trong kính hiển vi huỳnh quang, cường độ ánh sáng phát ra từ một điểm duy nhất được mô tả bằng hàm trải rộng điểm (PSF) và mẫu của nó là đĩa Airy. Độ phân giải của hệ huỳnh quang có thể được mô tả bằng bán kính của đĩa Airy, có thể được mô tả bằng Độ mở số của vật kính và bước sóng của ánh sáng kích thích xác định
