Ứng dụng và sử dụng nguyên lý kính hiển vi huỳnh quang
(1) Nguyên lý và đặc điểm cấu trúc của kính hiển vi huỳnh quang: kính hiển vi huỳnh quang sử dụng nguồn sáng điểm có hiệu suất phát sáng cao để phát ra ánh sáng có bước sóng nhất định (như tia cực tím 3650 in hoặc ánh sáng xanh tím 4200 in) thông qua hệ thống lọc như ánh sáng kích thích để kích thích mẫu vật. Sau khi chất huỳnh quang bên trong phát ra huỳnh quang với nhiều màu sắc khác nhau, nó được quan sát thông qua độ phóng đại của vật kính và thị kính. Bằng cách này, dưới nền tương phản mạnh, ngay cả khi huỳnh quang rất yếu, nó vẫn dễ dàng được xác định và có độ nhạy cao. Nó chủ yếu được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc, chức năng và thành phần hóa học của tế bào. Cấu trúc cơ bản của kính hiển vi huỳnh quang bao gồm kính hiển vi quang học thông thường cộng với một số phụ kiện (như nguồn sáng huỳnh quang, bộ lọc kích thích, bộ tách chùm hai màu và bộ lọc chặn, v.v.). Nguồn sáng huỳnh quang - thường sử dụng đèn thủy ngân áp suất cực cao (50-200W), có thể phát ra ánh sáng có bước sóng khác nhau, nhưng mỗi chất huỳnh quang có bước sóng kích thích tạo ra huỳnh quang mạnh nhất, do đó, bộ lọc kích thích ( Nói chung, có các bộ lọc kích thích tia cực tím, tím, xanh lam và xanh lục), chỉ cho phép ánh sáng kích thích có bước sóng nhất định đi qua và chiếu xạ mẫu vật, đồng thời hấp thụ ánh sáng khác. Sau khi mỗi chất được chiếu xạ bằng ánh sáng kích thích sẽ phát ra huỳnh quang nhìn thấy có bước sóng dài hơn bước sóng chiếu xạ trong thời gian rất ngắn. Huỳnh quang có tính đặc hiệu và thường yếu hơn ánh sáng kích thích. Để quan sát huỳnh quang cụ thể, cần có bộ lọc chặn (hoặc triệt tiêu) phía sau thấu kính vật kính. Nó có hai chức năng: một là hấp thụ và chặn ánh sáng kích thích đi vào thị kính, để không làm xáo trộn huỳnh quang và làm hỏng mắt; cách còn lại là chọn và cho huỳnh quang cụ thể đi qua, hiển thị màu huỳnh quang cụ thể. Hai bộ lọc phải được sử dụng cùng nhau.
Có hai loại kính hiển vi huỳnh quang xét theo đường quang của chúng:
1. Kính hiển vi huỳnh quang truyền qua: Nguồn sáng kích thích được truyền qua vật liệu mẫu qua một thấu kính ngưng tụ để kích thích huỳnh quang. Bộ thu trường tối thường được sử dụng và bộ thu thông thường cũng có thể được sử dụng để điều chỉnh gương sao cho ánh sáng kích thích được chuyển hướng và đi vòng tới mẫu vật. Đây là một kính hiển vi huỳnh quang cũ. Ưu điểm là huỳnh quang mạnh ở độ phóng đại thấp, nhưng nhược điểm là huỳnh quang giảm khi tăng độ phóng đại. Vì vậy, tốt hơn là quan sát các vật liệu mẫu lớn hơn.
2. Kính hiển vi huỳnh quang Epi là một loại kính hiển vi huỳnh quang mới được phát triển trong thời hiện đại. Sự khác biệt là ánh sáng kích thích rơi từ vật kính xuống bề mặt mẫu vật, nghĩa là, cùng một vật kính được sử dụng làm vật kính ngưng tụ chiếu sáng và vật kính để thu huỳnh quang. Cần phải thêm một bộ tách chùm lưỡng sắc trong đường dẫn ánh sáng, cách uranium ánh sáng 45 độ. Ánh sáng kích thích được phản xạ vào vật kính và thu lại trên mẫu. Huỳnh quang do mẫu tạo ra và ánh sáng kích thích được phản xạ bởi bề mặt thấu kính của thấu kính vật kính và bề mặt kính che đi vào thấu kính vật kính cùng lúc và quay trở lại bộ tách chùm hai màu để tạo ra ánh sáng kích thích Tách khỏi huỳnh quang , ánh sáng kích thích dư được hấp thụ bởi các bộ lọc chặn. Chẳng hạn như thay đổi sang kết hợp bộ lọc kích thích/bộ tách chùm tia hai màu/bộ lọc chặn khác nhau, nó có thể đáp ứng nhu cầu của các sản phẩm phản ứng huỳnh quang khác nhau. Ưu điểm của loại kính hiển vi huỳnh quang này là độ chiếu sáng của trường nhìn đồng đều, hình ảnh rõ ràng và độ phóng đại càng lớn thì huỳnh quang càng mạnh.
(2) Cách sử dụng kính hiển vi huỳnh quang.
1. Bật nguồn sáng, đèn thủy ngân siêu cao áp cần làm nóng trong vài phút để đạt điểm sáng nhất.
2. Kính hiển vi huỳnh quang truyền qua cần lắp đặt bộ lọc kích thích cần thiết giữa nguồn sáng và tụ điện, đồng thời lắp bộ lọc chặn tương ứng phía sau vật kính. Kính hiển vi huỳnh quang Epi cần lắp bộ lọc kích thích/bộ tách chùm tia hai màu/bộ lọc chặn theo yêu cầu vào các khe trên đường dẫn ánh sáng.
3. Quan sát bằng thấu kính có độ phóng đại thấp và điều chỉnh tâm của nguồn sáng sao cho nó nằm ở trung tâm của toàn bộ điểm chiếu sáng theo thiết bị điều chỉnh của các mẫu kính hiển vi huỳnh quang khác nhau.
4. Đặt mẫu vật vào và quan sát sau khi lấy nét. Trong quá trình sử dụng cần chú ý: không quan sát trực tiếp bằng đầu lọc để không gây tổn thương mắt; khi quan sát mẫu vật bằng thấu kính dầu phải sử dụng thấu kính dầu đặc biệt không có huỳnh quang; sau khi đèn thủy ngân cao áp tắt không thể bật lại ngay được, cần phải kiểm tra. Nó có thể được khởi động lại sau 5 phút, nếu không nó sẽ không ổn định và ảnh hưởng đến tuổi thọ của đèn thủy ngân.
(3) Quan sát các tế bào được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang màu cam acridine 001 phần trăm dưới kính hiển vi huỳnh quang trên bục giảng dạy bằng bộ lọc ánh sáng xanh tím. Nhân và tế bào chất bị kích thích tạo ra hai màu huỳnh quang khác nhau (xanh đậm và đỏ cam).
