Đếm trực tiếp vi sinh vật bằng kính hiển vi
Nguyên lý thí nghiệm
Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng máy đo huyết sắc tố là phương pháp đếm vi sinh vật thường được sử dụng. Ưu điểm của phương pháp này là trực quan và nhanh chóng. Đặt huyền phù vi khuẩn được pha loãng thích hợp (hoặc huyền phù bào tử) vào buồng đếm giữa lam kính và nắp kính của máy đo huyết sắc tố, rồi đếm dưới kính hiển vi. Vì thể tích của buồng đếm là cố định (0.1mm2), nên nó có thể được chuyển đổi thành tổng số vi sinh vật trên một đơn vị thể tích tùy theo số lượng vi sinh vật quan sát được dưới kính hiển vi. Vì phương pháp này đếm tổng số vi khuẩn sống và chết nên còn được gọi là phương pháp đếm tổng số vi khuẩn.
Máy đo huyết sắc tố thường là một tấm kính đặc biệt có bốn rãnh tạo thành ba bệ. Bệ ở giữa được chia thành hai nửa bằng một rãnh ngang ngắn. Một lưới được khắc trên bệ ở mỗi bên. Mỗi lưới được chia thành chín ô vuông lớn. Hình vuông lớn ở giữa là phòng đếm. Vi sinh vật được đếm trong buồng đếm. Cấu trúc của bảng đếm tế bào máu được thể hiện trên Hình Ⅷ-1.
Quy mô của phòng đếm thường có hai thông số kỹ thuật, một là hình vuông lớn được chia thành 16 ô vuông ở giữa và mỗi ô vuông ở giữa được chia thành 25 ô vuông nhỏ (Hình Ⅷ-2); cái còn lại là một hình vuông lớn. Hình vuông được chia thành 25 ô vuông ở giữa, mỗi ô vuông ở giữa được chia thành 16 ô vuông nhỏ (Hình Ⅷ-1, C). Nhưng dù là loại bảng đếm nào thì số lượng ô vuông nhỏ trong mỗi ô vuông lớn đều như nhau, tức là 16×25=400 ô vuông nhỏ, như trong Hình Ⅷ-2.
Chiều dài cạnh của mỗi hình vuông lớn là 1 mm và diện tích của mỗi hình vuông lớn là 1 mm2. Sau khi đậy nắp kính, chiều cao giữa kính trượt và kính đậy là 0,1 mm nên thể tích của buồng đếm là 0,1mm3.
Khi đếm, thường đếm tổng số vi khuẩn trong năm lưới ở giữa, sau đó lấy giá trị trung bình của mỗi lưới ở giữa, sau đó nhân với 16 hoặc 25 để có tổng số vi khuẩn trong một lưới lớn, sau đó Chuyển đổi sang tổng số vi khuẩn trong 1ml dung dịch vi khuẩn.
Thiết bị phòng thí nghiệm
Máy đo huyết sắc tố, kính hiển vi, lá kính, mao quản vô trùng;
Vật liệu thí nghiệm
Huyền phù Saccharomyces cerevisiae
Quy trình thí nghiệm (phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi vi sinh vật)
1. pha loãng
Pha loãng hỗn dịch Saccharomyces cerevisiae đúng cách. Nếu dung dịch vi khuẩn không đặc thì không cần pha loãng.
2. Phòng đếm kính hiển vi
Trước khi thêm mẫu, thực hiện kiểm tra bằng kính hiển vi buồng đếm của tấm đếm. Nếu có bụi bẩn thì cần phải làm sạch trước khi đếm.
3. thêm mẫu
Đậy đĩa hồng cầu sạch và khô bằng tấm kính đậy, sau đó dùng ống nhỏ giọt vô trùng nhỏ một giọt dung dịch Saccharomyces cerevisiae đã pha loãng từ mép tấm kính (không quá nhiều) sao cho dung dịch vi khuẩn được hòa tan. gần với khoảng trống dọc theo khoảng trống. Thẩm thấu mao mạch tự đi vào buồng đếm và buồng đếm chung có thể chứa đầy chất lỏng vi khuẩn. Hãy cẩn thận để không có bọt khí.
4. số lượng kính hiển vi
Sau khi nghỉ 5 phút, đặt máy đo huyết sắc tố lên bệ của kính hiển vi, trước tiên sử dụng thấu kính công suất thấp để tìm vị trí của buồng đếm, sau đó chuyển sang thấu kính công suất cao để đếm. Nếu thấy dung dịch vi khuẩn quá đặc hoặc quá loãng trước khi đếm thì cần điều chỉnh lại độ pha loãng trước khi đếm. Nói chung, việc pha loãng mẫu cần khoảng 5-10 vi khuẩn trong mỗi tế bào. Mỗi buồng đếm chọn lọc vi khuẩn ở 5 ô giữa (4 ô góc và ô trung tâm tùy chọn) để đếm. Vi khuẩn trên đường lưới thường chỉ được tính ở đường trên và bên phải. Trường hợp nấm men nảy chồi, khi kích thước thân chồi đạt 1/2 tế bào mẹ thì đếm 2 vi khuẩn. Đếm một mẫu để tính hàm lượng vi khuẩn trong mẫu từ các giá trị đếm được trong hai buồng đếm.
5. Vệ sinh máy đo huyết áp
Sau khi sử dụng, rửa sạch tấm đếm tế bào máu trên vòi bằng tia nước, không rửa bằng vật cứng và tự làm khô hoặc dùng máy sấy tóc sau khi rửa. Kiểm tra bằng kính hiển vi, quan sát xem có vi khuẩn còn sót lại hoặc các chất cặn khác trong mỗi tế bào hay không. Nếu chưa sạch thì phải giặt nhiều lần cho đến khi sạch.
