Sự khác biệt và đặc điểm giữa kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi quang học thông thường
Kính hiển vi huỳnh quang khác với kính hiển vi quang học thông thường. Nó không quan sát mẫu vật thông qua sự chiếu sáng của nguồn sáng thông thường. Thay vào đó, nó sử dụng ánh sáng có bước sóng nhất định (thường là tia cực tím, ánh sáng xanh tím) để kích thích vật liệu huỳnh quang trong mẫu vật dưới kính hiển vi, khiến nó phát ra huỳnh quang. Do đó, Nguồn sáng của kính hiển vi huỳnh quang không đóng vai trò chiếu sáng trực tiếp mà là nguồn năng lượng kích thích vật liệu huỳnh quang bên trong của mẫu vật. Sở dĩ chúng ta quan sát được mẫu vật không phải do sự chiếu sáng của nguồn sáng mà là hiện tượng huỳnh quang do chất huỳnh quang trong mẫu hấp thụ năng lượng ánh sáng kích thích gây ra. Có thể thấy rằng đặc điểm chính của kính hiển vi huỳnh quang là nguồn sáng của nó có thể cung cấp một lượng lớn ánh sáng kích thích trong một phạm vi bước sóng cụ thể, do đó các chất huỳnh quang trong mẫu vật được kiểm tra có thể thu được cường độ ánh sáng kích thích cần thiết. Đồng thời, kính hiển vi huỳnh quang phải có hệ thống lọc tương ứng. Kính hiển vi huỳnh quang là một công cụ thiết yếu cho mô hóa học huỳnh quang tiên tiến. Nó bao gồm nguồn sáng siêu cao áp, hệ thống lọc (bao gồm các tấm lọc kích thích và triệt tiêu), hệ thống quang học và hệ thống chụp ảnh. Nó sử dụng ánh sáng có bước sóng nhất định để kích thích mẫu vật phát ra huỳnh quang.
1. Các cách kích thích huỳnh quang: Theo dải bước sóng của ánh sáng, người ta chia làm hai loại: phương pháp kích thích bằng tia UV (dùng phương pháp chiếu sáng bằng tia cực tím) và phương pháp kích thích BV (dùng ánh sáng xanh tím). Phương pháp kích thích bằng tia cực tím sử dụng ánh sáng cực tím có bước sóng ngắn hơn 400nm để kích thích. Không có ánh sáng kích thích nhìn thấy được trong phương pháp này, do đó huỳnh quang quan sát được cho thấy huỳnh quang vốn có của thuốc nhuộm, giúp dễ dàng phân biệt huỳnh quang cụ thể trên mẫu vật với sự tự phát huỳnh quang của mô nền.
2. Phương pháp kích thích BV: kích thích từ tia cực tím đến ánh sáng xanh tập trung ở bước sóng 404nm và 434nm. Phương pháp này sử dụng ánh sáng xanh để chiếu sáng mẫu vật, do đó bộ lọc cắt của hệ thống quan sát huỳnh quang phải sử dụng bộ lọc có thể chặn hoàn toàn ánh sáng xanh và vượt qua hoàn toàn huỳnh quang xanh lục và vàng cần thiết. Thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng trong phương pháp kháng thể huỳnh quang. Bước sóng hấp thụ tối đa của ánh sáng kích thích và bước sóng phát xạ tối đa của huỳnh quang tương đối gần nhau, do đó bộ lọc được sử dụng trong phương pháp kích thích BV phải sử dụng bộ lọc cắt sắc nét. Phương pháp này có thể sử dụng ánh sáng xanh làm ánh sáng kích thích nên hiệu suất hấp thụ của sắc tố huỳnh quang cao hơn và thu được hình ảnh sáng hơn. Nhược điểm là không thể nhìn thấy huỳnh quang dưới 500nm, trong khi huỳnh quang trên 500nm khiến toàn bộ hình ảnh có màu vàng. Trong phương pháp kháng thể huỳnh quang, độ đặc hiệu của thuốc nhuộm huỳnh quang chủ yếu được đánh giá bằng màu sắc độc đáo của nó. Vì vậy, khi thảo luận về tính đặc hiệu tinh tế, những khuyết điểm nêu trên của phương pháp kích thích BV thường có tác động rất lớn.
