Sự khác biệt và đặc điểm giữa kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi quang học thông thường
Kính hiển vi huỳnh quang khác với kính hiển vi quang học thông thường ở chỗ nó không quan sát được mẫu vật dưới sự chiếu sáng của các nguồn sáng thông thường. Thay vào đó, nó sử dụng một bước sóng ánh sáng nhất định (thường là tia cực tím, ánh sáng tím xanh) để kích thích các chất huỳnh quang bên trong mẫu vật dưới kính hiển vi, khiến chúng phát ra huỳnh quang. Vì vậy, vai trò của nguồn sáng trong kính hiển vi huỳnh quang không phải là chiếu sáng trực tiếp mà là nguồn năng lượng để kích thích các chất huỳnh quang bên trong mẫu vật. Sở dĩ chúng ta quan sát được mẫu vật không phải do sự chiếu sáng của nguồn sáng mà là hiện tượng huỳnh quang được biểu hiện bởi các chất huỳnh quang bên trong mẫu vật sau khi hấp thụ năng lượng ánh sáng kích thích. Từ đó, có thể thấy rằng đặc điểm của kính hiển vi huỳnh quang chủ yếu là nguồn sáng của nó có thể cung cấp một lượng lớn ánh sáng kích thích trong một phạm vi bước sóng cụ thể, để các chất huỳnh quang trong mẫu vật có thể thu được cường độ ánh sáng kích thích cần thiết. Đồng thời, kính hiển vi huỳnh quang phải có hệ thống lọc tương ứng. Kính hiển vi huỳnh quang là một công cụ cơ bản trong hóa học mô huỳnh quang. Nó bao gồm các thành phần chính như nguồn sáng điện áp cực cao, hệ thống lọc (bao gồm các tấm lọc kích thích và triệt tiêu), hệ thống quang học và hệ thống chụp ảnh. Nó sử dụng ánh sáng có bước sóng nhất định để kích thích mẫu vật và phát ra huỳnh quang.
1. Phương pháp kích thích huỳnh quang: Theo dải bước sóng của ánh sáng, có hai loại: phương pháp kích thích bằng tia UV (dùng tia cực tím) và phương pháp kích thích BV (dùng ánh sáng tím xanh). Phương pháp kích thích bằng tia cực tím sử dụng tia cực tím gần có bước sóng ngắn hơn 400nm để kích thích. Phương pháp này không có ánh sáng kích thích nhìn thấy được nên huỳnh quang quan sát được thể hiện tính huỳnh quang vốn có của thuốc nhuộm, giúp dễ dàng phân biệt huỳnh quang cụ thể trên mẫu vật với huỳnh quang tự phát của mô nền.
2. Phương pháp kích thích BV: Phương pháp kích thích từ tia cực tím đến ánh sáng xanh tập trung ở bước sóng 404nm và 434nm. Phương pháp này sử dụng ánh sáng xanh lam để chiếu xạ mẫu vật, do đó, bộ lọc-ngắt của hệ thống quan sát huỳnh quang phải sử dụng bộ lọc có thể chặn hoàn toàn ánh sáng xanh lam và truyền hoàn toàn ánh sáng huỳnh quang xanh lục và vàng cần thiết. Chất màu huỳnh quang được sử dụng cho phương pháp kháng thể huỳnh quang. Bước sóng hấp thụ cực đại của ánh sáng kích thích và bước sóng phát xạ cực đại của huỳnh quang tương đối gần nhau nên bộ lọc dùng trong phương pháp kích thích BV phải sử dụng bộ lọc cắt sắc. Phương pháp này có thể sử dụng ánh sáng xanh làm ánh sáng kích thích nên hiệu suất hấp thụ của sắc tố huỳnh quang cao và thu được hình ảnh sáng hơn. Nhược điểm là không thể nhìn thấy huỳnh quang dưới 500nm, trong khi huỳnh quang trên 500nm khiến toàn bộ hình ảnh có màu vàng. Trong phương pháp kháng thể huỳnh quang, độ đặc hiệu chủ yếu được xác định bởi màu sắc đặc trưng của sắc tố huỳnh quang, vì vậy khi bàn về độ đặc hiệu tinh tế, nhược điểm của phương pháp kích thích BV nêu trên thường có tác động đáng kể.
