Sự khác biệt giữa Kính hiển vi thông thường và Kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng tia cực tím làm nguồn sáng để chiếu vật thể cần kiểm tra, để vật thể phát ra ánh sáng, sau đó quan sát vật thể dưới kính hiển vi. Nó chủ yếu được sử dụng cho các tế bào miễn dịch huỳnh quang. Nó có cấu tạo chủ yếu là nguồn sáng, hệ thống tấm kính lọc và hệ thống quang học để quan sát hình ảnh huỳnh quang của mẫu vật thông qua độ phóng đại của thị kính và vật kính. Chúng ta hãy xem sự khác biệt giữa kính hiển vi huỳnh quang này và kính hiển vi quang học thông thường.
1. Về phương pháp chiếu sáng
Phương pháp chiếu sáng của kính hiển vi huỳnh quang nói chung là soi sáng, nghĩa là nguồn sáng được chiếu lên mẫu thử qua vật kính.
2. Về mặt giải quyết
Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng tia cực tím làm nguồn sáng. Bước sóng tương đối ngắn, nhưng độ phân giải cao hơn so với kính hiển vi quang học thông thường.
3. Sự khác biệt trong bộ lọc
Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng hai bộ lọc đặc biệt, được sử dụng trước nguồn sáng để lọc ánh sáng khả kiến và được sử dụng giữa vật kính và thị kính để lọc tia cực tím, có thể bảo vệ mắt người.
Kính hiển vi huỳnh quang cũng là một loại kính hiển vi quang học, chủ yếu là do bước sóng kích thích của kính hiển vi huỳnh quang ngắn nên dẫn đến sự khác biệt về cấu tạo và công dụng giữa kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi thông thường. Hầu hết các kính hiển vi huỳnh quang đều có chức năng thu ánh sáng yếu rất tốt, do đó, dưới ánh sáng huỳnh quang cực yếu, khả năng chụp ảnh của nó cũng tốt. Cùng với sự cải tiến liên tục của kính hiển vi huỳnh quang trong những năm gần đây, tiếng ồn cũng đã giảm đi rất nhiều. Do đó ngày càng có nhiều kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng.
Kiến thức về kính hiển vi huỳnh quang hai photon
Nguyên tắc cơ bản của kích thích hai photon là: trong trường hợp mật độ photon cao, các phân tử huỳnh quang có thể hấp thụ đồng thời hai photon bước sóng dài và phát ra photon bước sóng ngắn hơn sau một thời gian ngắn được gọi là thời gian tồn tại ở trạng thái kích thích. . ; hiệu ứng này giống như việc sử dụng một photon có bước sóng bằng một nửa bước sóng dài để kích thích một phân tử huỳnh quang. Kích thích hai photon đòi hỏi mật độ photon cao. Để không làm hỏng các tế bào, kính hiển vi hai photon sử dụng các tia laser xung khóa chế độ năng lượng cao. Tia laser do tia laser này phát ra có năng lượng cực đại cao và năng lượng trung bình thấp, độ rộng xung của nó chỉ là 100 femto giây và tần số của nó có thể đạt tới 80 đến 100 megahertz. Khi sử dụng một vật kính có khẩu độ số cao để hội tụ các photon của tia laser xung, mật độ photon tại tiêu điểm của vật kính là cao nhất và sự kích thích hai photon chỉ xảy ra tại tiêu điểm của vật kính, vì vậy kính hiển vi hai photon không cần lỗ kim đồng tiêu, giúp cải thiện hiệu quả phát hiện huỳnh quang.
Trong các hiện tượng huỳnh quang nói chung, do mật độ photon của ánh sáng kích thích thấp, một phân tử huỳnh quang chỉ có thể hấp thụ một photon đồng thời, sau đó phát ra một photon huỳnh quang thông qua quá trình chuyển đổi bức xạ, đó là huỳnh quang đơn photon. Đối với quá trình kích thích huỳnh quang sử dụng laze làm nguồn sáng, có thể xảy ra huỳnh quang hai photon hoặc thậm chí nhiều photon. Tại thời điểm này, cường độ của nguồn sáng kích thích được sử dụng cao và mật độ photon đáp ứng yêu cầu của các phân tử huỳnh quang hấp thụ hai photon cùng một lúc. Trong quá trình sử dụng tia laser thông thường làm nguồn sáng kích thích, mật độ photon vẫn không đủ để tạo ra hiện tượng hấp thụ hai photon. Thông thường, một tia laser xung femto giây được sử dụng và công suất tức thời của nó có thể đạt tới mức megawatt. Do đó, bước sóng của huỳnh quang hai photon ngắn hơn bước sóng của ánh sáng kích thích, tương đương với hiệu ứng được tạo ra bởi sự kích thích ở một nửa bước sóng kích thích.
Kính hiển vi huỳnh quang hai photon có nhiều ưu điểm:
1) Ánh sáng có bước sóng dài ít bị tán xạ hơn ánh sáng có bước sóng ngắn và dễ dàng xuyên qua mẫu vật;
2) Các phân tử huỳnh quang bên ngoài mặt phẳng tiêu cự không bị kích thích, do đó nhiều ánh sáng kích thích hơn có thể chiếu tới mặt phẳng tiêu cự, do đó ánh sáng kích thích có thể xuyên qua các mẫu vật sâu hơn;
3) Ánh sáng cận hồng ngoại có bước sóng dài ít gây độc cho tế bào hơn ánh sáng có bước sóng ngắn;
4) Khi sử dụng kính hiển vi hai photon để quan sát mẫu vật, hiện tượng tẩy trắng và nhiễm độc ánh sáng chỉ xảy ra trong mặt phẳng tiêu điểm. Do đó, kính hiển vi hai photon phù hợp hơn kính hiển vi đơn photon để quan sát các mẫu vật dày, quan sát tế bào sống hoặc cho các thí nghiệm tẩy trắng điểm.
Kiến thức về kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu
Nguyên tắc cơ bản của kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu: một nguồn sáng điểm được sử dụng để chiếu xạ mẫu vật và một điểm sáng nhỏ được xác định rõ được hình thành trên mặt phẳng tiêu cự. gồm các bộ chia. Bộ tách chùm gửi huỳnh quang trực tiếp đến máy dò. Có một lỗ kim ở phía trước nguồn sáng và máy dò, tương ứng được gọi là lỗ kim chiếu sáng và lỗ kim phát hiện. Kích thước hình học của cả hai giống nhau, khoảng 100-200nm; so với điểm sáng trên mặt phẳng tiêu điểm, cả hai liên hợp với nhau, nghĩa là điểm sáng đi qua một loạt thấu kính và cuối cùng có thể được hội tụ vào lỗ kim chiếu sáng và lỗ kim phát hiện cùng một lúc. Bằng cách này, ánh sáng từ mặt phẳng tiêu điểm có thể được hội tụ trong phạm vi của lỗ phát hiện, trong khi ánh sáng tán xạ từ bên trên hoặc bên dưới mặt phẳng tiêu điểm bị chặn bên ngoài lỗ phát hiện và không thể chụp ảnh được. Tia laser quét từng điểm mẫu và ống nhân quang sau khi phát hiện lỗ kim cũng thu được hình ảnh tiêu điểm của điểm sáng tương ứng từng điểm, được chuyển đổi thành tín hiệu kỹ thuật số và truyền đến máy tính, cuối cùng được tổng hợp thành rõ ràng ảnh đồng tiêu của toàn bộ mặt phẳng tiêu cự trên màn hình.
Mỗi hình ảnh mặt phẳng tiêu cự thực sự là một mặt cắt ngang quang học của mẫu vật. Mặt cắt quang học này luôn có độ dày nhất định, còn được gọi là mặt cắt mỏng quang học. Do cường độ ánh sáng tại tiêu điểm lớn hơn nhiều so với cường độ tại điểm không tiêu điểm và ánh sáng mặt phẳng không tiêu điểm được lọc bởi lỗ kim, nên độ sâu trường của hệ thống tiêu cự xấp xỉ bằng 0 và quét dọc theo Z -axis có thể thực hiện chụp cắt lớp quang học, tạo thành một Quan sát phần quang học hai chiều tại điểm lấy nét của mẫu. Kết hợp quét mặt phẳng XY (mặt phẳng tiêu cự) với quét trục Z (trục quang), có thể thu được hình ảnh ba chiều của mẫu bằng cách tích lũy hình ảnh hai chiều của các lớp liên tục và được xử lý bằng phần mềm máy tính đặc biệt.
Nghĩa là, lỗ kim phát hiện và lỗ kim nguồn sáng luôn tập trung vào cùng một điểm, do đó huỳnh quang được kích thích bên ngoài mặt phẳng tiêu điểm không thể đi vào lỗ kim phát hiện.
Biểu hiện đơn giản của nguyên tắc làm việc của tiêu điểm laser là nó sử dụng tia laser làm nguồn sáng và trên cơ sở hình ảnh kính hiển vi huỳnh quang truyền thống, thêm một thiết bị quét laser và thiết bị lấy nét liên hợp, và là một hệ thống thu thập hình ảnh kỹ thuật số và xử lý thông qua điều khiển máy tính.
