Xác định số lượng vi sinh vật - Phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi!
Sự tăng trưởng quần thể vi khuẩn được biểu hiện bằng sự gia tăng số lượng tế bào hoặc sự gia tăng vật chất tế bào. Các phương pháp xác định số lượng tế bào bao gồm đếm trực tiếp dưới kính hiển vi, đếm đĩa, đánh giá độ đục bằng máy quang phổ, số MPN có xác suất lớn nhất và lọc qua màng. (lọc màng) v.v.. Các phương pháp đo các chất trong tế bào bao gồm xác định trọng lượng khô của tế bào, xác định các thành phần nhất định của tế bào như hàm lượng nitơ, hàm lượng RNA và DNA và xác định các sản phẩm chuyển hóa. Nói tóm lại, có nhiều phương pháp đo lường sự phát triển của vi sinh vật, mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng. Phương pháp nên được lựa chọn theo yêu cầu cụ thể của công việc. Thí nghiệm này chủ yếu giới thiệu phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi được sử dụng phổ biến trong sản xuất và nghiên cứu khoa học.
1. Yêu cầu về mục đích
1. Làm rõ nguyên lý đếm bằng bảng đếm tế bào máu.
2. Nắm vững phương pháp đếm vi sinh vật bằng bảng đếm tế bào máu.
2. Nguyên tắc cơ bản
Phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi là một phương pháp đơn giản, nhanh chóng và trực quan, đặt một lượng nhỏ huyền phù của mẫu cần kiểm tra lên một phiến kính đặc biệt có diện tích và thể tích xác định (còn gọi là máy đo vi khuẩn) và đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Phương pháp. Hiện nay, các máy đo vi khuẩn được sử dụng phổ biến trong và ngoài nước bao gồm: máy đo huyết sắc tố, máy đo vi khuẩn Peteroff-Hauser, máy đo vi khuẩn Hawksley, v.v. Chúng đều có thể được sử dụng để đếm nấm men, vi khuẩn, bào tử nấm mốc và các huyền phù khác và nguyên tắc cơ bản là giống nhau. Hai quầy vi khuẩn sau có tổng thể tích là 0.02mm3 sau khi được đậy bằng kính che và khoảng cách giữa kính che và phiến kính chỉ là 0,02mm. Do đó, vật kính ngâm trong dầu có thể được sử dụng để quan sát và phát hiện các tế bào nhỏ hơn như vi khuẩn. đếm. Ngoài việc sử dụng các máy đo vi khuẩn này, còn có một phương pháp ước tính quan sát trực tiếp tỷ lệ giữa diện tích vết bẩn với diện tích thị trường dưới kính hiển vi. Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra vi khuẩn trong sữa. Ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi là trực quan, nhanh chóng và dễ vận hành. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là kết quả đo được thường là tổng số vi khuẩn chết và vi khuẩn sống. Hiện nay có một số phương pháp khắc phục nhược điểm này như kết hợp nuôi cấy vi khuẩn sống nhuộm (thời gian ngắn) và bổ sung chất ức chế phân chia tế bào để đạt được mục đích chỉ đếm vi khuẩn sống.
Thí nghiệm này sử dụng máy đo huyết sắc tố làm ví dụ để tiến hành đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Để sử dụng hai máy đo vi khuẩn còn lại, vui lòng tham khảo hướng dẫn của từng nhà sản xuất. Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng máy đo huyết sắc tố là phương pháp đếm vi sinh vật thường được sử dụng. Bàn đếm là một tấm trượt đặc biệt có bốn rãnh tạo thành ba bệ; bệ rộng hơn ở giữa được chia thành hai nửa bằng một rãnh ngang ngắn và có lưới lưới ở mỗi bên của bệ. Mỗi ô vuông được chia thành chín ô vuông lớn, ô vuông lớn ở giữa là phòng đếm. Cấu trúc của bảng đếm tế bào máu được thể hiện trên Hình {{0}}. Nhìn chung có hai thông số kỹ thuật cho cân của buồng đếm. Một là hình vuông lớn được chia thành 25 hình vuông vừa và mỗi hình vuông trung bình được chia thành 16 hình vuông nhỏ (Hình 15-2); cái còn lại là một hình vuông lớn. Lưới hình vuông được chia thành 16 ô vuông trung bình và mỗi ô vuông trung bình được chia thành 25 ô vuông nhỏ. Tuy nhiên, dù là loại bảng đếm nào thì mỗi ô vuông lớn đều có 400 ô vuông nhỏ. Độ dài cạnh của mỗi hình vuông lớn là lmm, khi đó diện tích của mỗi hình vuông lớn là lmm2. Sau khi đậy nắp phiến, chiều cao giữa nắp phiến và phiến kính là 0,lmm nên thể tích của buồng đếm là 0,lmm3 (một phần mười nghìn mililit). Hình 15-1 Cấu trúc của bảng đếm tế bào máu (1) Hình 15-2 Cấu trúc của bảng đếm tế bào máu (2) A. Nhìn từ phía trước; B. Mặt cắt dọc; lưới ô vuông mở rộng, ô vuông lớn ở giữa là buồng đếm 1. Bảng đếm tế bào máu; 2. Phiếu bìa; 3. Khi đếm trong buồng đếm, thường đếm tổng số vi khuẩn trong 5 ô vuông, sau đó tìm giá trị trung bình của mỗi ô vuông rồi nhân với 25 hoặc 16 để được tổng số vi khuẩn trong 1 ô vuông lớn sau đó được chuyển đổi vào tổng số vi khuẩn có trong 1ml dung dịch vi khuẩn. Giả sử tổng số vi khuẩn ở 5 ô vuông ở giữa là A, hệ số pha loãng của dung dịch vi khuẩn là B. Nếu là một đĩa đếm có 25 ô vuông ở giữa thì tổng số vi khuẩn có trong 1mL dung dịch vi khuẩn {{ 23}} A/5×25×104× B=50000A·B (miếng) Tương tự, nếu là đĩa đếm có 16 ô vuông thì tổng số vi khuẩn có trong 1mL dung dịch vi khuẩn {{ 30}}A/5×16×104×B=32000A·B (miếng),,
