Xác định số lượng vi sinh vật - phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi!
Sự phát triển của quần thể vi khuẩn được biểu hiện bằng sự gia tăng số lượng tế bào hoặc tăng khối lượng tế bào. Các phương pháp xác định số lượng tế bào bao gồm phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi, phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, phương pháp tỷ lệ dầu quang điện, phương pháp xác suất cực đại và phương pháp lọc màng. Các phương pháp đo chất tế bào bao gồm xác định trọng lượng khô của tế bào, xác định một số thành phần tế bào như hàm lượng nitơ, RNA và DNA và xác định các chất chuyển hóa. Nói tóm lại, có nhiều phương pháp để đo sự phát triển của vi sinh vật, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng và nên được lựa chọn tùy theo tình hình cụ thể. Thí nghiệm này chủ yếu giới thiệu phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi thường được sử dụng trong sản xuất và nghiên cứu khoa học.
1. Mục đích Yêu cầu
1. Làm rõ nguyên tắc đếm tế bào máu.
2. Nắm vững phương pháp đếm vi sinh vật bằng máy đếm tế bào máu.
2. Nguyên tắc cơ bản
Phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và trực quan để đếm trực tiếp một lượng nhỏ huyền phù của mẫu cần thử trên một phiến kính đặc biệt có diện tích và thể tích nhất định (còn gọi là máy đếm vi khuẩn). phương pháp. Hiện tại, các máy đếm vi khuẩn thường được sử dụng trong và ngoài nước là: bảng đếm tế bào máu, máy đếm vi khuẩn Peteroff-Hauser và máy đếm vi khuẩn Hawksley, v.v. Chúng có thể được sử dụng để đếm nấm men, vi khuẩn, bào tử nấm mốc và các chất huyền phù khác, và nguyên tắc cơ bản là như nhau. Hai loại máy đếm vi khuẩn sau có tổng thể tích là 0.02mm3 sau khi được đậy bằng kính đậy và khoảng cách giữa kính đậy và phiến kính chỉ là 0,02mm nên dầu vật kính ngâm có thể được sử dụng để quan sát và quan sát các tế bào nhỏ như vi khuẩn. đếm. Ngoài các máy đo vi khuẩn này, còn có một phương pháp ước tính tỷ lệ diện tích của vết bôi với diện tích của trường thị giác được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi, thường được sử dụng để kiểm tra vi khuẩn của sữa. Ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi là trực quan, nhanh chóng và dễ vận hành. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là kết quả đo được thường là tổng của tế bào sống và tế bào chết. Hiện nay đã có một số phương pháp khắc phục nhược điểm này như nuôi cấy kết hợp nhuộm vi khuẩn còn sống (thời gian ngắn) và bổ sung chất ức chế phân bào để đạt được mục đích chỉ đếm vi khuẩn còn sống.
Trong thí nghiệm này, máy đo hemocytometer được sử dụng làm ví dụ cho việc đếm trực tiếp bằng kính hiển vi. Để sử dụng hai loại máy đếm vi khuẩn còn lại, vui lòng tham khảo hướng dẫn của từng nhà sản xuất. Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng máy đo hemocytometer là phương pháp thường được sử dụng để đếm vi sinh vật. Đĩa đếm là một phiến kính đặc biệt, trên đó có ba bệ do bốn rãnh tạo thành; bệ rộng hơn ở giữa được chia thành hai nửa bằng một khe ngang ngắn, mỗi bên bệ đều có lưới. Mỗi lưới được chia thành chín ô vuông lớn và ô vuông lớn ở giữa là phòng đếm. Cấu trúc của đĩa đếm tế bào máu được thể hiện trong Hình l{{{{10}}}}. Quy mô của phòng đếm thường có hai thông số kỹ thuật, một là hình vuông lớn được chia thành 25 ô vuông ở giữa và mỗi ô vuông ở giữa được chia thành 16 ô vuông nhỏ (Hình 15-2); kia là một hình vuông lớn. Hình vuông được chia thành 16 ô vuông ở giữa và mỗi ô vuông ở giữa được chia thành 25 ô vuông nhỏ, nhưng bất kể đó là loại bảng đếm nào, thì có 400 ô vuông nhỏ trong mỗi ô vuông lớn. Độ dài cạnh của mỗi hình vuông lớn là 1mm và diện tích của mỗi hình vuông lớn là 1mm2. Sau khi đậy bằng kính đậy, chiều cao giữa kính đậy và kính trượt là 0,1mm, do đó thể tích của buồng đếm là 0,lmm3 (một phần nghìn mililit). Hình 15-1 Cấu trúc của bảng đếm tế bào máu (1) Hình 15-2 Cấu trúc của bảng đếm tế bào máu (2) A. Mặt trước; B. Hình chiếu mặt cắt dọc; Ô lưới phóng to, ô vuông lớn ở giữa là buồng đếm 1. Đĩa đếm tế bào máu; 2. Kính che; 3. Khi đếm trong buồng đếm, thường đếm tổng số vi khuẩn trong năm ô vuông, sau đó tính giá trị trung bình của mỗi ô vuông và nhân với 25 hoặc 16 để có được Tổng số vi khuẩn trong một ô vuông lớn, sau đó chuyển đổi thành tổng số vi khuẩn trong 1ml dung dịch vi khuẩn. Gọi tổng số vi khuẩn trong năm ô vuông là A và tỷ lệ pha loãng của dung dịch vi khuẩn là B. Nếu đó là một đĩa đếm có 25 ô vuông, thì tổng số vi khuẩn trong 1 mL dung dịch vi khuẩn {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(miếng) Tương tự, nếu đó là một đĩa đếm có 16 ô vuông trung bình, thì tổng số vi khuẩn trong 1mL dung dịch vi khuẩn=A/ 5×16×104×B=32000A·B (mảnh)
3. Trang thiết bị
1. Vi khuẩn
Saccharomyces cerevisiae
2. Dụng cụ hoặc đồ dùng khác
Hemocytometer, kính hiển vi, coverslip, ống nhỏ giọt mao quản vô trùng.
4. Các bước thao tác
1. Pha chế huyền phù vi khuẩn
Saccharomyces cerevisiae được bào chế thành dịch huyền phù vi khuẩn với nồng độ thích hợp bằng nước muối sinh lý vô trùng.
2. Phòng đếm kính hiển vi
Trước khi thêm mẫu, kiểm tra buồng đếm của đĩa đếm bằng kính hiển vi. Nếu có bụi bẩn, cần phải làm sạch và lau khô trước khi đếm.
3. Thêm mẫu
Che hemocytometer khô và sạch bằng một nắp đậy, sau đó sử dụng ống nhỏ giọt mao dẫn vô trùng để nhỏ một giọt huyền phù Saccharomyces cerevisiae đã lắc từ mép của nắp trượt, và để dung dịch vi khuẩn tự động di chuyển dọc theo khe hở bằng thẩm thấu mao dẫn. Bước vào phòng đếm, phòng đếm chung có thể chứa đầy chất lỏng vi khuẩn. Khi lấy mẫu, trước tiên hãy lắc dung dịch vi khuẩn; khi thêm mẫu không được tạo bọt khí trong buồng đếm.
4. Kính hiển vi đếm
Sau khi thêm mẫu, đứng yên trong 5 phút, sau đó đặt máy đo hemocytometer lên bàn kính hiển vi, trước tiên hãy tìm vị trí của buồng đếm bằng kính hiển vi công suất thấp, sau đó chuyển sang kính hiển vi công suất cao để đếm. Điều chỉnh cường độ ánh sáng kính hiển vi thích hợp. Đối với kính hiển vi sử dụng gương để chiếu sáng, chú ý không để ánh sáng lệch về một phía, nếu không sẽ không dễ dàng nhìn rõ các đường vuông góc của phòng đếm trong tầm nhìn, hoặc chỉ có các đường thẳng đứng hoặc đường ngang sẽ được nhìn thấy. Nếu thấy dung dịch vi khuẩn quá đậm đặc hoặc quá loãng trước khi đếm cần điều chỉnh lại độ loãng trước khi đếm. Nói chung, việc pha loãng mẫu cần khoảng 5 đến 10 vi khuẩn trong mỗi tế bào nhỏ. Mỗi buồng đếm chọn 5 ô ở giữa (tùy chọn 4 góc và một ô ở giữa ở giữa) để đếm. Các ô nằm trên đường lưới thường chỉ được tính ở các đường trên và bên phải. Trong trường hợp nảy chồi của nấm men, khi kích thước của chồi bằng một nửa tế bào mẹ thì được tính là hai tế bào vi khuẩn. Để đếm một mẫu, tính hàm lượng vi khuẩn trong mẫu bằng cách tính giá trị trung bình từ hai buồng đếm.
5. Rửa số lượng tế bào máu
Sau khi sử dụng, rửa sạch bảng đếm tế bào máu dưới vòi nước, không chà bằng vật cứng và tự làm khô bảng đếm tế bào sau khi rửa bằng máy sấy tóc. Kiểm tra bằng kính hiển vi để quan sát xem có vi khuẩn còn sót lại hoặc các chất lắng đọng khác trong mỗi tế bào nhỏ hay không. Nếu chưa sạch thì phải rửa đi rửa lại nhiều lần cho đến khi sạch.
