Xác định quần thể vi sinh vật - phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi!
I. Yêu cầu về mục đích
1,Làm rõ nguyên tắc đếm tấm hematocrit.
2, Nắm vững phương pháp đếm vi sinh vật bằng tấm hematocrit.
II. Nguyên tắc cơ bản
Phương pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi là một lượng nhỏ huyền phù của mẫu cần kiểm tra trên một phiến kính đặc biệt có diện tích và thể tích xác định (còn được gọi là máy đếm vi khuẩn), trong kính hiển vi đếm trực tiếp một phương pháp đơn giản, nhanh chóng, trực quan. Hiện nay, các máy đếm vi khuẩn thường được sử dụng trong và ngoài nước là: đĩa đếm tế bào máu, máy đếm vi khuẩn Peteroff-Hauser và máy đếm vi khuẩn Hawksley, v.v., có thể dùng cho nấm men, vi khuẩn, bào tử nấm mốc và các chất huyền phù khác, nguyên tắc cơ bản là giống nhau. Hai loại bộ đếm sau có tổng thể tích là 0.02 mm3 sau khi đặt lớp phủ và khoảng cách giữa lớp phủ và lát mang chỉ là 0,02 mm, do đó các ô nhỏ hơn như vi khuẩn có thể được quan sát và đếm bằng vật kính ngâm trong dầu. Ngoài việc sử dụng các máy đếm này, còn có một phương pháp ước tính tỷ lệ diện tích phết với vùng quan sát được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi, phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra vi khuẩn trong sữa bò. Ưu điểm của phương pháp đếm kính hiển vi trực tiếp là trực quan, nhanh chóng và dễ vận hành. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là kết quả thường là tổng số sinh vật sống và chết. Có một số phương pháp khắc phục nhược điểm này như kết hợp nuôi cấy vi khuẩn sống nhuộm vi buồng (thời gian ngắn) và bổ sung chất ức chế phân bào để đạt được mục đích chỉ đếm số sinh vật sống.
Các bước thao tác
1, Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn
Dùng nước muối vô trùng để tạo huyền phù vi khuẩn cho men bia với nồng độ thích hợp.
2, Buồng đếm gương
Trước khi thêm mẫu, buồng đếm của tấm đếm phải được kiểm tra trước. Nếu có bụi bẩn thì cần phải làm sạch và thổi khô trước khi đếm.
3, Thêm mẫu
Đĩa đếm tế bào máu sạch và khô được phủ một lớp phủ, sau đó sử dụng buret mao mạch vô trùng để lắc huyền phù men bia từ mép của lớp phủ để nhỏ một giọt nhỏ, sao cho chất lỏng vi khuẩn dọc theo khe hở bằng sự xâm nhập của mao mạch vào trong. buồng đếm tự động, nói chung buồng đếm có thể chứa đầy chất lỏng vi khuẩn. Khi lấy mẫu, trước tiên phải lắc đều dung dịch vi khuẩn; khi thêm mẫu vào buồng đếm không được có bọt khí.
4, Đếm bằng kính hiển vi
Sau khi thêm mẫu, để yên trong 5 phút, sau đó đặt đĩa đếm tế bào máu lên bệ chứa kính hiển vi, trước tiên hãy tìm vị trí của buồng đếm có độ phóng đại thấp, sau đó đổi sang độ phóng đại cao để đếm. Điều chỉnh cường độ ánh sáng của kính hiển vi một cách thích hợp, đối với kính hiển vi có đèn phản xạ cũng cần chú ý ánh sáng không bị lệch về một phía, nếu không thì trường nhìn không dễ làm rõ đường lưới buồng đếm, hoặc chỉ nhìn thấy đường dọc hoặc chỉ nhìn thấy đường ngang. Nếu thấy dịch vi khuẩn quá đặc hoặc quá loãng trước khi đếm thì cần điều chỉnh lại độ pha loãng trước khi đếm. Yêu cầu pha loãng mẫu chung khoảng 5 đến 10 vi khuẩn trong mỗi tế bào là phù hợp. Mỗi buồng đếm chọn sinh vật ở 5 ngăn giữa (4 góc và 1 ngăn giữa ở giữa) để đếm. Các sinh vật nằm trên các đường lưới thường chỉ được tính ở các đường trên và bên phải. Trong trường hợp nấm men nảy chồi, khi cơ thể nảy chồi đạt kích thước bằng một nửa tế bào mẹ thì được tính là hai sinh vật. Đếm một mẫu từ hai buồng đếm ở giá trị trung bình để tính hàm lượng vi khuẩn trong mẫu.
5. Vệ sinh tấm hematocrit
Sau khi sử dụng, rửa sạch đĩa đếm tế bào máu bằng nước dưới vòi nước, không dùng vật cứng để rửa và chải, tự lau khô hoặc dùng máy sấy tóc sấy khô sau khi rửa. Kiểm tra bằng kính hiển vi tấm để xem liệu có bất kỳ sinh vật còn sót lại hoặc các chất kết tủa khác trong mỗi ngăn hay không. Nếu chưa sạch thì phải giặt lại nhiều lần cho đến khi sạch.
