So sánh giữa kính hiển vi đồng tiêu và kính hiển vi quang học thông thường
Kính hiển vi quang học tổng hợp
Kính hiển vi sinh học nói chung bao gồm ba phần, đó là: ① hệ thống chiếu sáng, bao gồm nguồn sáng và bình ngưng; ② Hệ thống khuếch đại quang học, bao gồm vật kính và thị kính, là bộ phận chính của kính hiển vi. Để loại bỏ quang sai hình cầu và quang sai màu, cả thị kính và thấu kính vật kính đều bao gồm các nhóm thấu kính phức tạp; (3) thiết bị cơ khí, dùng để cố định vật liệu và quan sát thuận tiện.
Hình ảnh của kính hiển vi có rõ hay không không chỉ phụ thuộc vào độ phóng đại mà còn phụ thuộc vào độ phân giải của kính hiển vi. Độ phân giải đề cập đến khả năng của kính hiển vi (hoặc nơi mà mắt người cách mục tiêu 25cm) để phân biệt khoảng cách nhỏ của vật thể. Độ phân giải phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng, tỷ lệ khẩu độ và chiết suất của môi trường, được biểu thị bằng công thức:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Trong đó: n{0}} chiết suất của môi trường; Góc gương=(góc mở của mẫu vật với khẩu độ thấu kính) và khẩu độ số NA=. Góc gương luôn nhỏ hơn 180? Do đó, giá trị zui của sina/2 phải nhỏ hơn 1.
Chiết suất của thủy tinh dùng để chế tạo thấu kính quang học là 1,65 ~ 1,78, chiết suất của môi trường được sử dụng càng gần với chiết suất của thủy tinh thì càng tốt. Đối với vật kính khô, môi trường là không khí và tỷ lệ khẩu độ thường là 0.05 ~ 0,95; Thấu kính dầu sử dụng nhựa đường thơm làm môi trường và tốc độ mở thấu kính có thể gần 1,5.
Bước sóng của ánh sáng thông thường là 400~700nm nên độ phân giải của kính hiển vi không nhỏ hơn 0,2μm và độ phân giải của mắt người là 0,2mm nên độ phóng đại lớn của zui được thiết kế bởi kính hiển vi thông thường thường là 1000X x.
Tại sao bạn cần một kính hiển vi đồng tiêu?
1. Kính hiển vi quang học đã được hoàn thiện nhờ nỗ lực và cải tiến của những người đi trước vĩ đại của chúng ta. Trên thực tế, kính hiển vi thông thường có thể cung cấp cho chúng ta những hình ảnh hiển vi đẹp một cách đơn giản và nhanh chóng. Tuy nhiên, một sự kiện mang lại sự đổi mới mang tính cách mạng cho thế giới kính hiển vi gần như hoàn hảo này đã xảy ra, đó là phát minh ra “kính hiển vi đồng tiêu quét laser”. Kính hiển vi mới này có đặc điểm là sử dụng hệ thống quang học chỉ trích xuất thông tin hình ảnh trên mặt phẳng tập trung tiêu điểm và khôi phục thông tin thu được trong bộ nhớ hình ảnh trong khi thay đổi tiêu điểm, sao cho hình ảnh sống động với thông tin ba chiều hoàn chỉnh. có thể thu được. Bằng phương pháp này, có thể thu được thông tin về hình dạng bề mặt mà kính hiển vi thông thường không thể xác nhận được. Ngoài ra, đối với kính hiển vi quang học thông thường, "cải thiện độ phân giải" và "làm sâu độ sâu tiêu cự" là những điều kiện trái ngược nhau, đặc biệt là ở độ phóng đại cao, nhưng đối với kính hiển vi đồng tiêu, vấn đề này đã được giải quyết.
2. Ưu điểm của hệ thống quang học đồng tiêu
Hệ thống quang học đồng tiêu chiếu sáng điểm mẫu và ánh sáng phản xạ cũng được các thụ thể điểm tiếp nhận. Khi mẫu được đặt ở vị trí tiêu điểm, gần như toàn bộ ánh sáng phản xạ có thể chạm tới cơ quan cảm quang, nhưng khi mẫu lệch khỏi tiêu điểm, ánh sáng phản xạ không thể chạm tới cơ quan cảm quang. Có nghĩa là, trong hệ thống quang học đồng tiêu, chỉ có hình ảnh trùng với tiêu điểm mới được xuất ra, còn ánh sáng phân tán và ánh sáng tán xạ vô dụng sẽ được che chắn.
3. Tại sao nên sử dụng tia laser?
Trong hệ thống quang học đồng tiêu, mẫu được chiếu sáng và ánh sáng phản xạ cũng được tiếp nhận bởi một tế bào cảm quang điểm. Vì vậy, nguồn sáng điểm trở nên cần thiết. Laser thuộc về một nguồn sáng rất điểm. Trong hầu hết các trường hợp, nguồn sáng của kính hiển vi đồng tiêu sử dụng nguồn sáng laser. Ngoài ra, các đặc tính của laser như tính đơn sắc, tính định hướng và hình dạng chùm tia tuyệt vời cũng là những lý do quan trọng khiến nó được sử dụng rộng rãi.
4. Có thể quan sát theo thời gian thực dựa trên chức năng quét tốc độ cao.
Trong quá trình quét laser, Bộ làm lệch quang học âm thanh (phần tử chính AO) được sử dụng theo hướng ngang và gương servo Galvano được sử dụng theo hướng dọc. Do không có bộ phận rung cơ học trong bộ phận lệch quang học âm thanh nên có thể quét ở tốc độ cao và có thể quan sát theo thời gian thực trên màn hình giám sát. Tốc độ cao của máy ảnh này là một dự án rất quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ lấy nét và truy xuất vị trí.
5. Mối liên hệ giữa vị trí tiêu điểm và độ sáng
Trong hệ thống quang học đồng tiêu, khi mẫu được đặt chính xác vào vị trí tiêu điểm, độ sáng lớn, trước và sau mẫu, độ sáng của nó sẽ giảm mạnh (đường liền nét trong Hình 4). Độ chọn lọc nhạy cảm này của mặt phẳng tiêu cự cũng là nguyên tắc đo hướng cao của kính hiển vi tiêu cự và mở rộng độ sâu tiêu cự. Ngược lại, kính hiển vi quang học thông thường không có sự thay đổi độ sáng rõ ràng trước và sau vị trí tiêu điểm (đường chấm trong Hình 4).
6. Độ tương phản và độ phân giải cao
Trong kính hiển vi quang học nói chung, ánh sáng phản xạ lệch khỏi tiêu điểm sẽ gây nhiễu và sẽ chồng lên phần hình ảnh tiêu điểm, do đó làm giảm độ tương phản của hình ảnh. Ngược lại, trong hệ thống quang học đồng tiêu, ánh sáng tán xạ bên ngoài tiêu điểm và ánh sáng tán xạ bên trong thấu kính vật kính gần như bị loại bỏ hoàn toàn, do đó có thể thu được hình ảnh có độ tương phản rất cao. Ngoài ra, do ánh sáng đi qua vật kính hai lần nên hình ảnh điểm được làm sắc nét trước và độ phân giải của kính hiển vi cũng được cải thiện.
7. Chức năng định vị quang học
Trong hệ thống quang học đồng tiêu, ánh sáng phản xạ của bộ phận không phải tiêu điểm được che chắn bởi các vi lỗ. Do đó, khi quan sát một mẫu ba chiều, một hình ảnh tương tự được hình thành sau khi cắt mẫu bằng tiêu điểm sẽ được hình thành (Hình 5). Hiệu ứng này được gọi là định vị quang học, thuộc một trong những chuyên ngành của hệ thống quang học đồng tiêu.
8. Chức năng bộ nhớ di chuyển tập trung
Cái gọi là ánh sáng phản xạ bên ngoài tiêu điểm được che chắn bởi các vi lỗ. Mặt khác, có thể coi mọi điểm trên ảnh tạo bởi hệ quang học đồng tiêu đều trùng với tiêu điểm. Do đó, nếu mẫu ba chiều được di chuyển dọc theo hướng trục Z (trục quang), hình ảnh sẽ được tích lũy và lưu trữ trong bộ nhớ, và zui cuối cùng sẽ có được hình ảnh được hình thành do sự trùng hợp của toàn bộ mẫu và tiêu điểm. . Theo cách này, chức năng lấy nét sâu vô hạn được gọi là chức năng bộ nhớ di động.
9. Chức năng đo hình dạng bề mặt
Trong chức năng di chuyển tiêu điểm, hình dạng bề mặt của mẫu có thể được đo theo cách không tiếp xúc bằng cách thêm vòng ghi chiều cao. Dựa trên chức năng này, có thể ghi lại tọa độ trục Z được hình thành bởi giá trị độ sáng lớn của zui trong mỗi pixel và dựa trên thông tin này, có thể thu được thông tin liên quan đến hình dạng bề mặt của mẫu.
10. Chức năng đo kích thước vi mô có độ chính xác cao
Bộ phận nhận ánh sáng sử dụng cảm biến hình ảnh CCD một chiều nên không bị ảnh hưởng bởi độ nghiêng quét của thiết bị quét, nhờ đó có thể hoàn thành phép đo có độ chính xác cao. Ngoài ra, do chức năng bộ nhớ di chuyển lấy nét với độ sâu lấy nét có thể điều chỉnh được áp dụng đồng thời nên có thể loại bỏ lỗi đo do bù tiêu cự gây ra.
11. Phân tích hình ảnh ba chiều
Sử dụng chức năng đo hình dạng bề mặt, có thể dễ dàng tạo ra hình ảnh ba chiều của bề mặt mẫu. Không chỉ vậy, còn có thể thực hiện nhiều loại phân tích, chẳng hạn như: đo độ nhám bề mặt, diện tích, thể tích, diện tích bề mặt, độ tròn, bán kính, chiều dài zui, chu vi, trọng tâm, ảnh chụp cắt lớp, biến đổi FFT, đường thẳng đo chiều rộng và như vậy.
Kính hiển vi quét đồng tiêu laser có thể được sử dụng không chỉ để quan sát hình thái tế bào mà còn để phân tích định lượng các thành phần sinh hóa trong tế bào, thống kê mật độ quang và đo hình thái tế bào.
