Đánh giá về một số kỹ thuật hiển vi siêu phân giải
Đối với kính hiển vi ánh sáng thông thường, nhiễu xạ ánh sáng giới hạn độ phân giải hình ảnh ở khoảng 250 nm. Ngày nay, các kỹ thuật siêu phân giải có thể cải thiện điều này hơn gấp 10 lần. Kỹ thuật này chủ yếu đạt được thông qua ba phương pháp: kính hiển vi định vị đơn phân tử, bao gồm kính hiển vi định vị cảm quang (PALM) và kính hiển vi tái tạo quang học ngẫu nhiên (STORM); kính hiển vi chiếu sáng có cấu trúc (SIM); và kính hiển vi suy giảm phát xạ kích thích (STED). Lựa chọn công nghệ siêu phân giải như thế nào là điều ai cũng quan tâm. Mathew Stracy, một nhà nghiên cứu sau tiến sĩ tại Đại học Oxford, Vương quốc Anh, cho biết: “Thật không may, không có nguyên tắc đơn giản nào để quyết định sử dụng phương pháp nào. "Mỗi thứ có lợi thế và bất lợi riêng của nó." Tất nhiên, các nhà khoa học cũng đang tìm cách chọn phương pháp phù hợp cho một dự án cụ thể. "Trong bối cảnh hình ảnh sinh học, các yếu tố chính cần xem xét bao gồm: độ phân giải không gian và thời gian, độ nhạy cảm với hiện tượng quang hóa, khả năng ghi nhãn, độ dày mẫu và huỳnh quang nền hoặc huỳnh quang tự thân của tế bào." Cách thức hoạt động Các kính hiển vi siêu phân giải khác nhau hoạt động theo những cách khác nhau. Trong trường hợp PALM và STORM, chỉ một phần nhỏ chất đánh dấu huỳnh quang được kích thích hoặc quang hóa tại một thời điểm nhất định, cho phép định vị độc lập chúng với độ chính xác cao. Trải qua quá trình này với tất cả các nhãn huỳnh quang sẽ tạo ra một hình ảnh siêu phân giải hoàn chỉnh. Stefan Hell, một trong những người đoạt giải Nobel Hóa học năm 2014 và là giám đốc Viện Hóa lý Sinh học Max Planck, cho biết: "Hệ thống PALM/STORM tương đối dễ cài đặt, nhưng rất khó áp dụng, vì đèn huỳnh quang nhóm phải có khả năng quang hóa. Hạn chế Nhược điểm là chúng cần phát hiện một phân tử huỳnh quang duy nhất trong bối cảnh của một tế bào và kém tin cậy hơn STED." STED sử dụng một xung laze để kích thích huỳnh quang và một tia laze hình vòng để dập tắt huỳnh quang, chỉ để lại Huỳnh quang trung gian có kích thước nanomet cho độ phân giải siêu cao. Quét toàn bộ mẫu tạo ra một hình ảnh. "Ưu điểm của STED là nó là một công nghệ nút bấm," Hell giải thích. "Nó hoạt động giống như một kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu tiêu chuẩn." Nó cũng có thể chụp ảnh các tế bào sống bằng cách sử dụng các chất huỳnh quang như protein huỳnh quang màu lục hoặc vàng và thuốc nhuộm có nguồn gốc từ rhodamine. So sánh tham số Mặc dù tất cả các kỹ thuật siêu phân giải đều vượt qua kính hiển vi ánh sáng thông thường về độ phân giải, nhưng chúng khác nhau. SIM gần như tăng gấp đôi độ phân giải lên khoảng 100 nm. PALM và STORM có thể giải quyết các mục tiêu 15 nm. Theo Hell, STED cung cấp độ phân giải không gian 30 nm trong các tế bào sống và 15 nm trong các tế bào cố định. Khi nói đến các ứng dụng cụ thể, chúng ta cũng phải xem xét tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm. Trong một số trường hợp, độ phân giải thấp hơn nhưng SNR cao hơn có thể mang lại hình ảnh tốt hơn so với điều ngược lại (độ phân giải cao hơn nhưng SNR thấp hơn). Tốc độ thu nhận hình ảnh cũng rất quan trọng, đặc biệt đối với các tế bào sống. Stracy cho biết: “Tất cả các kỹ thuật siêu phân giải đều chậm hơn so với kỹ thuật chụp ảnh huỳnh quang thông thường. "PALM/STORM là chậm nhất, cần hàng chục nghìn khung hình để thu được một hình ảnh, SIM cần hàng chục khung hình và STED là công nghệ quét, vì vậy tốc độ thu thập phụ thuộc vào kích thước của trường nhìn." Ngoài các tế bào sống hoặc các tế bào Hình ảnh cố định, một số nhà khoa học cũng muốn hiểu cách các vật thể di chuyển. Stracy quan tâm đến việc tìm hiểu động lực học của các hệ thống sinh học trong các tế bào sống, không chỉ là những hình ảnh tĩnh. Ông kết hợp PALM với theo dõi hạt đơn lẻ để phân tích động lực học trong các tế bào sống. Bằng cách này, anh ta có thể theo dõi trực tiếp các phân tử đánh dấu khi chúng thực hiện các chức năng của mình. Tuy nhiên, ông tin rằng SIM không phù hợp để nghiên cứu các quá trình động này ở cấp độ phân tử, nhưng do tốc độ thu nhận nhanh nên nó đặc biệt phù hợp để quan sát động lực học của các cấu trúc lớn hơn, chẳng hạn như toàn bộ nhiễm sắc thể. Kết quả mới nhất Năm 2017, nhóm của Hell đã báo cáo về kính hiển vi siêu phân giải MINFLUX trên Science. Theo Hell, phương pháp siêu phân giải này lần đầu tiên đạt được độ phân giải không gian 1 nm. Ngoài ra, nó có thể theo dõi từng phân tử trong tế bào sống nhanh hơn ít nhất 100 lần so với các phương pháp khác. Các nhà khoa học khác cũng đánh giá cao kính hiển vi MINFLUX. Shechtman nói: “Các ứng dụng và phương pháp tiếp cận mới liên tục được phát triển, nhưng có hai tiến bộ nổi bật đối với tôi. Một là MINFLUX. "Nó sử dụng một cách tiếp cận khéo léo để có được vị trí phân tử rất chính xác." Về sự phát triển thú vị thứ hai, Shechtman đã đề cập đến WE Moerner và các đồng nghiệp của ông tại Đại học Stanford. Moerner cũng là người nhận giải Nobel Hóa học năm 2014. Một trong những người chiến thắng. Để giải quyết hạn chế về độ phân giải hình ảnh gây ra bởi sự tán xạ dị hướng của các phân tử đơn huỳnh quang, các nhà khoa học đã sử dụng các phân cực kích thích khác nhau để xác định hướng và vị trí của các phân tử. Ngoài ra, chúng đã phát triển các bề mặt đồng tử mỏng manh. Những kỹ thuật này cải thiện khả năng bản địa hóa các cấu trúc. Giới thiệu về nhãn huỳnh quang Trong nhiều ứng dụng siêu phân giải, nhãn thực sự quan trọng. Ngoài ra còn có một số công ty cung cấp các sản phẩm liên quan. Ví dụ, Miltenyi của Đức đã hợp tác với Abberior, một công ty được thành lập bởi Stefan Hell, để cung cấp dịch vụ liên hợp kháng thể tùy chỉnh cho thuốc nhuộm hiển vi siêu phân giải. Một số công ty khác cũng cung cấp các điểm đánh dấu phù hợp. Christoph Eckert, nhân viên tiếp thị của ChromoTek cho biết: "Các Nano-Boosters của chúng tôi rất nhỏ, chỉ 1,5 kDa và có độ đặc hiệu cao". Những protein này liên kết với các protein huỳnh quang xanh và đỏ (GFP và RFP). Chúng có nguồn gốc từ các mảnh kháng thể alpaca, được gọi là VHH hoặc nanobody, với các đặc tính liên kết tuyệt vời và chất lượng ổn định mà không có sự biến đổi giữa các lô. Các điểm đánh dấu này phù hợp với các kỹ thuật siêu phân giải khác nhau bao gồm SIM, PALM, STORM và STED. Ai-Hui Tang, trợ lý giáo sư tại Trường Y thuộc Đại học Maryland và các đồng nghiệp đã sử dụng GFP-Booster và STORM của ChromoTek để khám phá sự lan truyền thông tin trong hệ thần kinh. Họ đã tìm thấy các cụm nano phân tử, được gọi là cột nano, trong các tế bào thần kinh tiền synap và sau synap. Các nhà khoa học tin rằng cấu trúc này cho thấy hệ thống thần kinh trung ương sử dụng các nguyên tắc đơn giản để duy trì và điều chỉnh hiệu quả của khớp thần kinh. Nhiều phiên bản khác nhau của hình ảnh siêu phân giải và ngày càng nhiều phương pháp đang đưa các nhà khoa học đi sâu hơn vào những bí ẩn sinh học. Bằng cách phá vỡ giới hạn nhiễu xạ của ánh sáng khả kiến, các nhà sinh học thậm chí có thể "theo dõi chặt chẽ" hoạt động của các tế bào.
